中文标题：MafF通过circ-ITCH/miR-224-5p轴调控，并在肝癌中作为肿瘤抑制因子

发表期刊：Oncol Res

影响因子：4.362

发表时间：2020年7月

合作单位：广州医科大学

运用技术：慢病毒载体构建，慢病毒包装，稳转细胞株构建（由辉骏生物提供技术支持）

● 研究背景

肝细胞癌（HCC）是世界上第六大常见癌症，也是癌症相关死亡率的第二大原因。临床上，HCC的特点是侵袭性强，治疗机会有限，预后不良。考虑到HCC早期评估和治疗的复杂性，进一步了解HCC进展的调控机制和上游信号分子对于早期诊断和治疗具有重要意义。MafF是碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子Maf（肌肉腱P膜纤维肉瘤癌基因）家族的成员。与其他两种小Maf蛋白（MafG和MafK）类似，MafF缺乏明显的反式激活结构域，但可以与小Mafs同源二聚化或与其他bZIP蛋白异源二聚化，如Cap'n'Collar（CNC）家族成员p45 NFE2，Nrf1和Nrf25,6。通过作为转录抑制因子或激活因子的同二聚体或异二聚体，MafF在基因表达的控制中起重要作用，并参与多种生理和病理过程，如造血，细胞应激反应和癌症发展。

● 研究结果

1.     MafF在HCC组织和细胞中的表达降低

为了探讨MafF在HCC中的作用，研究者首先通过免疫组化检测76对HCC和癌旁组织中MafF蛋白的表达。如图1A所示，MafF蛋白主要分布在细胞核中，其在HCC组织中的表达水平低于癌旁组织。此外，MafF的表达随着HCC的进展而降低(图1B)。接下来，研究者检测了MafF蛋白在人正常肝细胞L-O2和3个人HCC细胞系SMMC7721、Huh7和Hep3B中的表达。Western blot结果显示，MafF蛋白在HCC细胞中的表达低于L-O2细胞(图1C)。

图1

2. MafF过表达抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡

考虑到MafF在HCC中下调，研究者进一步通过在HCC细胞中过表达MafF来研究其功能。通过慢病毒感染和嘌呤霉素筛选建立了Maff高表达SMMC7721和Hep3B细胞系，QRT-PCR和Western blot结果表明，Maff mRNA和蛋白水平在两个细胞中均显著升高(图2A和B)。CCK-8检测结果显示，Maff过表达抑制细胞增殖(图2C和D)；Maff过表达细胞的集落数明显少于对照细胞(图2E和F)。通过流式细胞仪分析Maff对肝癌细胞凋亡的影响，发现MafF过表达显著增加了SMMC7721和Hep3B细胞的凋亡率(图3)，提示Maff过表达可抑制肝癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

图2

图3

3. MiR-224-5p可下调肝癌细胞Maff的表达

MiRNA可以影响mRNA的稳定性或mRNA的翻译，主要是通过结合特异性mRNA的3’-UTR来实现的。研究者首先使用了四种miRNA靶标预测工具(Miranda、Targetcan、miRWalk和Starbase)来研究可能与Maff mRNA结合的miRNA，四个数据库中重叠的两个miRNA：miR-224-5P和miR-760，被选择用于进一步研究(图4A和B)。MiRNA模拟转染后，mir-224-5P和miR-760的表达均显著增加(图4C和D)。荧光素酶报告分析结果显示，与对照miR-NC转染组相比，miR-224-5p模拟物和MafF 3’-UTR-WT共转染细胞后荧光素酶活性受到抑制。而MafF 3’-UTR WTt与miR-224-5p或miR-NC共转染后，荧光素酶活性无明显差异。然而，miR-760模拟转染并不影响所有组细胞的荧光素酶活性(图4E和F)，这些结果表明miR-224-5p能直接靶向Maff mRNA，而miR-760不能。Western blot分析进一步证实，miR-224-5p显著下调MafF蛋白的表达(图4G和H)。综上所述，miR224-5p直接靶向MafF mRNA，并降低Maff的蛋白水平。

图4

4. CircRNA circ-ITCH是HCC中miR-224-5p的分子海绵

据报道，circ-ITCH作为miR-224-5P的分子海绵，在膀胱癌中消除了miR-224-5P的致癌作用。为了探讨circ-ITCH是否通过海绵作用于miR-224-5p来影响HCC的进展，研究者首先检测了circ-ITCH和miR-224-5p在HCC中的表达。QRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，circ-ITCH在肝癌组织中表达下调，并且随着肝癌的进展而降低(图5A)，这与Maff的表达模式一致。之后检测了L-O2和三个肝癌细胞系中circ-ITCH和miR224-5p的表达水平，结果显示与L-O2细胞相比，HCC细胞表现出较低的circ-ITCH水平和较高的miR-224-5p水平(图5B)。随后的相关分析表明，肝癌组织中circ-ITCH水平与miR-224-5p水平呈负相关(图5C)。RNA pull down结果显示，与对照组相比，circ-ITCH探针中miR-224-5p明显富集。这些结果表明，circ-ITCH是miR-224-5P的分子海绵，并与其直接结合(图5D)。

图5

5. Circ-ITCH/miR-224-5p轴通过调节MafF表达来调节细胞增殖和凋亡

基于上述结果，研究者推测MafF的肿瘤抑制作用可能由circ-ITCH/miR-224-5p轴调控。为了验证推测，研究者通过慢病毒感染构建了circ-ITCH过表达细胞，结果显示circ-ITCH的强制表达显著上调了MafF蛋白表达水平（图6A-F），促进细胞增殖（图6G）并诱导细胞凋亡（图6H）。挽救实验结果显示，miR-224-5p转染逆转了circ-ITCH诱导的MafF蛋白的上调（图6B，C，E和F），部分抵消了circ-ITCH的抗增殖和促凋亡作用（图6G，H和I）。总的来说，这些数据反映了MafF在HCC中的表达降低可以通过circ-ITCH/miR-224-5p轴调节，并因此促进肿瘤进展（图6J）。

图6