中文标题：TLR4是高脂饮食下结直肠癌生长的主要调控因子

发表期刊：Cell Death & Disease

中科院分区：1区

影响因子：9.685

发表时间：2021年8月

合作单位：广州中医药大学

运用技术：iTRAQ蛋白质组学分析（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

研究表明，高脂肪饮食（HFD）与结直肠癌(CRC)的发展有关。Toll样受体4 (TLR4)是一种跨膜的受体蛋白，能识别病原体并与之结合，启动先天免疫。已知TLR4在结直肠癌(CRC)中过表达，促进了肿瘤的生长、转移。棕榈酸可以激活TLR4，但棕榈酸是否影响CRC中TLR4的表达尚不清楚。本研究进一步探索了高脂肪饮食下CRC生长的关键调节因子及其作用机制。

● 研究结果

1. 高脂肪饮食增加了CRC中TLR4的表达

首先，研究人员将CRC细胞SW480接种到裸鼠体内，建立异种移植模型，并将小鼠随机分为两组：高脂肪饮食喂养组(HD组)和对照饮食喂养组(CD组)，15天后，HD组的肿瘤大小和重量均大于CD组(图1A)。之后，在HD组中随机选择一半的小鼠进行对照饲料喂养(HCD组)，而其余小鼠继续喂食HFD (HHD组)20天(图1A)。结果发现HCD组的肿瘤大小和重量明显小于HHD组(图1A)。接下来的转录组测序调查了不同喂养条件下CRC的基因表达谱差异，在检测到的19707个基因中，331个基因在，HHD样本中上调，1189个基因下调(图1B)，GO富集分析显示，受饮食影响的基因大部分参与细胞代谢过程(图1C)。研究人员发现，在10个TLR同源物中，HFD喂养使TLR4上调了4倍。qPCR（图1D）和WB检测(图1E)均显示，TLR4在HD组表达较高，在HCD组表达降低，在HHD组的水平持续升高（图1D）。以上可知，HFD增加了CRC中TLR4的表达。

  图1

2. 棕榈酸增加CRC细胞中TLR4的表达

HFD如何影响CRC中TLR4的表达呢？脂质组学研究了不同饮食下CRC的脂质变化，主成分分析显示，饮食干预影响了CRC的脂质谱(图2A)。与CD组相比，HD组总脂肪酸水平较高，HCD组总脂肪酸水平降低，HHD组总脂肪酸水平持续升高(图2B)。靶向脂质组学结果显示，棕榈酸和硬脂酸水平随饮食干预而变化，推测其可能影响TLR4的表达。体外细胞实验显示，棕榈酸处理显著提高了SW480细胞(图2C)和HCT116细胞(图2D)的TLR4 mRNA水平和蛋白水平(图2E, F)。然而，硬脂酸不影响TLR4的表达(图2G, H)。这些结果表明，HFD增加了CRC中的棕榈酸和硬脂酸水平，但只有棕榈酸增加了TLR4的表达。

图2

3. PU.1的表达对棕榈酸增强TLR4的表达至关重要

接着，他们研究了CRC细胞中棕榈酸是否影响TLR4基因转录，发现棕榈酸处理显著增加了TLR4启动子上的2个已知转录调控因子PU.1和Sp1的mRNA (图3A, C, E, G)和蛋白表达(图3B, D ,F ,H)。在棕榈酸处理前分别敲低SP1和PU.1（图3I、K），发现只有当Sp1敲低时，棕榈酸显著增加了TLR4的表达 (图3J, L)，表明PU.1是CRC中棕榈酸增强TLR4表达所必需的。根据以往TLR4启动子上PU.1结合位点的报道（图3M），研究人员进行了双荧光素酶实验。结果显示，棕榈酸显著提高了TLR4启动子的活性，但PU.1_1、PU.1_2和PU.1_5的突变均消除了这种活性促进作用(图3N)，表明- 106、-172和-204位点的PU.1结合位点对棕榈酸介导的TLR4转录至关重要。

图3

4. 棕榈酸依赖TLR4来促进CRC细胞增殖

棕榈酸不仅增加了CRC细胞中TLR4的表达，还增加了MyD88和TIRAP的表达(图4A, B)。然而，表面等离子体共振(SPR)结果发现棕榈酸不与TLR4结合(图4C)。棕榈酸处理后NFκB磷酸化增强(图4D, E)，表明TLR4信号通路的激活至少部分是由于癌细胞中TLR4、MyD88和TIRAP表达的增强，而不是由于棕榈酸与TLR4蛋白的直接结合。此外，棕榈酸增加了CRC细胞的增殖，而TLR4抑制剂C34会消除这种作用 (图4F, G)。为了进一步表明TLR4介导了棕榈酸对CRC细胞增殖的促进，他们敲除了HCT116细胞中的TLR4 (图4H)，发现棕榈酸不能增加TLR4_KO细胞的增殖(图4I)。这些数据表明棕榈酸以TLR4依赖的方式增加结直肠癌细胞的增殖。

图4

5. HFD或富棕榈酸饮食(PAD)以TLR4依赖的方式增加结直肠癌的生长

接下来，他们研究了体内TLR4是否介导了HFD相关的结直肠癌生长。将野生型HCT116细胞或敲除TLR4的HCT116细胞皮下接种于裸鼠，并随机分为HFD组和CD组。HFD饲料的总脂肪酸为254.5 g，其中棕榈酸含量为49.9 g，占总脂肪酸的19.6%。另一组小鼠饲喂富含棕榈酸的饲料，其中棕榈酸含量为106.5 g，脂肪酸含量为262.8 g，棕榈酸占总脂肪酸的40.5%。各组之间的食物摄取量没有明显差异。在18天的饮食干预期间，饮食对小鼠的体重没有显著影响(图5A, B)。然而，对于接种野生型HCT116细胞的小鼠来说，HFD和PAD分别显著增加了肿瘤体积(图5C, E)和重量(图5F)。对于接种HCT116TLR4_KO细胞的小鼠，HFD和PAD均未能增加肿瘤体积(图5D, E)和重量。这些数据表明HFD和PAD在体内以TLR4依赖的方式增加CRC的生长。

图5

6. TLR4调节HFD条件下的CRC代谢

TLR4是否通过调节肿瘤代谢促进HFD条件下的CRC生长呢？研究人员发现，敲除TLR4后，肿瘤组织中乙酰辅酶a羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FASN)、肉碱棕榈酰基转移酶-1 (cct -1)、中链酰基辅酶a脱氢酶(MCAD)、葡萄糖转运蛋白GLUT1以及调节细胞脂肪生成和脂质稳态的主要转录因子-甾醇调节元件结合转录因子-1 (SREBP-1c)的表达显著增强（图6A）。基于肿瘤组织的iTRAQ蛋白质组学结果，敲除TLR4改变了CRC的代谢(图6B-D)，还影响了其他代谢酶，这些代谢酶位于线粒体或细胞质，主要参与能量产生，并协同参与甘油三酯生物合成、葡萄糖代谢、脂肪酸活化、脂肪酸、甘油三酯和酮类合成。STRING分析(图6E)所示，TLR4对HFD条件下CRC代谢的调节作用不是单个代谢酶的作用，而是多种酶的协同作用。敲除TLR4消除了CRC中HFD引起的ATP水平升高（图6F）和β-catenin表达上调 (图6G)，表明在HFD条件下，CRC中β-catenin调节的能量稳态与TLR4活性有关。综上所述，这些数据表明TLR4通过控制代谢来调节HFD下结直肠癌的生长。

图6

●   总结

在本研究中，脂质组学和转录组学数据显示，高脂肪饮食不仅增加了CRC小鼠模型的肿瘤重量，还增加了棕榈酸水平和TLR4表达。棕榈酸通过PU.1蛋白调控TLR4的表达。iTRAQ蛋白质组学数据显示，TLR4敲低改变了肿瘤组织中的代谢酶谱，从而完全消除了高脂肪饮食对ATP产生和肿瘤生长的促进作用。

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