中文标题：LINC00173通过刺激鼻咽癌中RAB1B介导的PA2G4和SDF4的分泌促进肿瘤进展

发表期刊：Molecular Oncology

中科院分区：2区

影响因子：7.449

发表时间：2023年1月

合作单位：中山大学肿瘤防治中心

运用技术：LC-MS/MS蛋白质谱鉴定，RNA pull down（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

鼻咽癌（NPC）中超过70%的患者最初被诊断为局部晚期疾病，约20%的鼻咽癌患者在治疗后出现远处转移或局部复发的情况。急需探索NPC进展的机制，以确定NPC患者的有效治疗靶点。长非编码RNA（lncRNA）没有编码蛋白质功能，但可以作为其他生物分子的信号、诱饵、引物或支架，构成一个巨大而精细的调节系统。之前的微阵列筛选显示，LINC00173在NPC组织中显著上调，本研究进一步确定了LINC00173的作用机制。

● 研究结果

1. LINC00173在鼻咽癌中上调并与预后不良相关

基于之前的微阵列数据(GSE126683)，研究者筛选发现了在鼻咽癌组织中显著上调的LINC00173（图1A），并通过qPCR实验验证了这一结果（图1B）。此外，LINC00173在NPC细胞系中的表达也显著高于正常鼻咽上皮细胞系NP69（图1C）。Kaplan-Meier生存率分析显示， LINC00173高表达的患者总生存期、无病生存期和远端无转移生存期较差（图1D-F）。通过单变量和多变量Cox回归分析，发现LINC00173的表达水平和TNM分期是显著且独立的预后决定因素，研究者将LINC00173的表达水平与TNM分期相结合，构建了一个综合预后模型，将NPC患者分为三组。Kaplan-Meier曲线分析发现，这些组的总生存期、无病生存期和远端无转移生存期存在显著差异。这些结果说明，LINC00173在NPC的预后方面具有重要价值（图1G-I）。

  图1

2. LINC00173促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力                                                            

接着，研究者通过敲除和过表达LINC00173来研究其在NPC中失调的生物学功能，发现敲除LINC00173严重阻碍了细胞增殖和克隆形成能力（图2A，B），过表达LINC00173则有相反效果（图2C，D）。此外，敲除LINC00173显著削弱了细胞的迁移和侵袭能力（图2E），而过表达LINC00173则增强了细胞的迁徙和侵袭能力（2F）。这些结果表明，LINC00173促进NPC的细胞增殖和转移，这可能是导致预后不良的原因。

图2

3. LINC00173与RAB1B直接结合

为了研究LINC00173的作用机制，研究者用生物素标记的LINC00173正义或反义序列（0173 SS或AS）进行了RNA pull down和质谱检测（LC-MS/MS），寻找LINC00173的互作蛋白。pull down产物的SDS-PAGE银染结果显示有特异性蛋白条带，质谱也检测到了RAB1B蛋白（图3A）。RNA pull down WB实验验证并确定了LINC00173和RAB1B在NPC细胞中存在高度相互作用（图3B）。之后进行的RIP qPCR实验也观察到LINC00173明显富集（图3C，D）。核质RNA提取检测发现LINC00173主要定位于细胞质中（图3E）。进一步的FISH和免疫荧光（IF）分析发现，LINC00173和RAB1B蛋白在细胞质中共定位（图3F），并且LINC00173的敲除或过表达都不会影响RAB1B的mRNA或蛋白质水平（图3G，H）。这些发现表明LINC00173不会影响RAB1B的表达，可能直接与细胞质中的RAB1B蛋白相互作用。

图3

4. LINC00173通过RAB1B介导的方式促进PA2G4和SDF4的分泌

RAB1B作为RAB蛋白家族的一员，可以调节蛋白质和脂质的胞外转运。为了研究LINC00173是否通过调节RAB1B介导的胞外转运过程发挥作用，研究者用质谱方法筛选了受LINC00173/RAB1B影响的分泌蛋白。当SUNE1细胞稳定干扰LINC00173后，为其更换无血清培养基，16h后收集细胞培养上清液进行LC-MS/MS分析（图4A），在筛选到的10个差异蛋白（图4B）中，PA2G4和SDF4差异最大，并且在LINC00173敲除后显著下降（图4C）。之后，研究者分别对细胞裂解物和浓缩上清液中的RAB1B、PA2G4、SDF4蛋白进行了Western-blot检测，发现LINC00173敲除并不影响细胞裂解物中的RAB1B、PA2G4和SDF4蛋白水平，而显著降低了细胞上清液中的PA2G4和SDF4水平（图4D）。那么LINC00173/RABB是否通过胞外途径调节PA2G4和SDF4蛋白的分泌呢？研究者用胞外途径化学抑制剂Exo-1处理NPC细胞，发现PA2G4和SDF4水平显著下降了（图4E），表明LINC00173/RABB通过胞外途径促进PA2G4或SDF4的分泌。接着，研究者将RAB1B过表达质粒转染到稳定干扰LINC00173的NPC细胞株中，RAB1B的过表达可以逆转PA2G4和SDF4蛋白分泌水平（图4F）。这些结果确定了LINC00173可以通过RAB1B介导的胞外途径中刺激PA2G4和SDF4的分泌。

图4

5. 敲除PA2G4或SDF4逆转了LINC00173介导的NPC进展

LINC00173/RABB是否通过促进PA2G4和SDF4蛋白分泌来促进NPC的恶性进展呢？研究者将LINC00173过表达质粒与PA2G4-shRNA或SDF4-shRNA质粒共转染到NPC细胞中，生长曲线和克隆形成实验结果显示，敲低PA2G4或SDF4显著逆转了LINC00173过表达诱导的细胞生长和增殖作用（图5A-D）。此外，过表达LINC00173显著增加了细胞的迁移和侵袭能力，敲低PA2G4或SDF4后细胞侵袭能力减弱（图5E-F）。这些数据表明，LINC00173可以通过促进PA2G4和SDF4的分泌来促进NPC细胞的增殖、迁移和侵袭。

图5

6. LINC00173敲低对NPC肿瘤的体内生长和转移抑制作用

接下来，研究者利用皮下肿瘤生长模型进一步分析LINC00173在NPC体内生长和转移中的作用。结果显示，敲低LINC00173显著延缓了肿瘤的生长，与对照组相比，肿瘤的体积、大小和重量都减少了（图6A-C）。接着，研究者建立腹股沟淋巴结转移模型，并通过尾静脉注射建立肺转移模型。结果显示，敲低LINC00173的腹股沟淋巴结较小、体积减小（图6D-F）。肿瘤H&E染色表明，敲低LINC00173的肿瘤侵袭性较低，对皮肤或肌肉的侵袭能力减弱（图6G），淋巴结转移率明显低于对照组（图6H，I）。此外，在肺转移模型中，LINC00173基因敲低组在肺表面表现出较小的结节（图6J），转移结节较对照组明显减少和缩小（图6K，L）。

图6

●   总结

本研究确定了LINC00173在鼻咽癌中上调，并与预后不良相关，通过RNA pull down实验筛选并验证了LINC00173的互作蛋白RAB1B，阐明了LINC00173通过RAB1B的胞外转运功能，促进PA2G4或SDF4分泌，在体内和体外促进NPC细胞的增殖、迁移和侵袭。

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