中文标题：snoRNA相关lncRNA通过激活RNA编辑酶ADAR1促进白血病进展

发表期刊：Cell Discovery

中科院分区：1区

影响因子：38.079

发表时间：2022年11月

合作单位：中山大学生命科学学院

运用技术：LC-MS/MS蛋白质谱鉴定（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究概述

长链非编码RNA (lncRNAs)与大多数典型的mRNA相似，通常是5 '帽子和3 'polyA结构。然而，这项新研究鉴定了一种新型的、与snoRNA相关的lncRNA，命名为LNC-SNO49AB，它包含两个C/D盒snoRNA序列SNORD49A和SNORD49B，具有5 '帽子和3 'snoRNA结构。LNC-SNO49AB在白血病患者样本中高表达，沉默LNC-SNO49AB能在体外和体内显著抑制白血病的进展。从机制上看，LNC-SNO49AB通过一种有别于snoRNA的作用方式在核仁中起作用，它可以直接结合ADAR1，促进其形成同源二聚体，使其具有更高的酶活性，进而促进全基因组RNA”A到I”编辑，最终促进白血病进展。

● 研究结果

1. 白血病中LNC-SNO49AB的特征

研究人员首先检测了snoRNA相关的LNC-SNO49AB是否存在。SNORD49A和SNORD49B均位于17号染色体p11.2区域非编码基因SNHG29的第二个内含子上(图1a)。Northern blot实验证实，四种白血病细胞系中只存在一个成熟转录本(图1b)。RACE和测序结果显示该转录本包含SNHG29的第一外显子和第二外显子的5 '端至SNORD49A的3 '端，全长804 nt(图1c) ，缺少polyA尾巴(图1d)。RIP-qPCR实验发现LNCSNO49AB可以被抗m7G抗体富集(图1e)，这与真核生物snoRNA经典的m3G或其他修饰不同。他们将这些lncRNA命名为“lnc-snoRNA”，其具有5 '端m7G和3 '端snoRNA结构(图1f)。靶向LNC-SNO49AB中非snoRNA区域的siRNA不会改变SNORD49A或SNORD49B的表达(图1g)，表明LNC-SNO49AB是一种稳定的lncRNA，而不是snoRNA前体。生物信息学和多聚体分析表明，LNC-SNO49AB不具有编码潜能(图1h)。

图1

2. LNC-SNO49AB加工需要完整的位点特异性snoRNA

SNORD49A和SNORD49B属于C/D盒型snoRNA，包括其终端附近的C、D盒及远处的D '、C '盒(图2a)。通常，C/D盒型snoRNA的保守基序直接结合核心蛋白(snoRNPs)，如纤原蛋白(FBL)、NOP58、NOP56和15.5 K(图2a)。那么这些核心蛋白是否与LNC-SNO49AB相互作用呢？RNA免疫沉淀(RIP)实验显示，LNC-SNO49AB可以被FBL抗体富集(图2b)。RNA pull down实验也证实LNCSNO49AB可以结合上述四个核心蛋白(图2c-e)。当同时删除SNORD49A和SNORD49B结构域时，LNC-SNO49AB不再与FBL相互作用(图2f)。抑制FBL表达导致snoRNAs和lnc-snoRNA显著下调(图2g)，表明snoRNP复合物形成对LNC-SNO49AB的稳定性至关重要。接着，依次删除SNORD49B和SNORD49A的C、D、C′和D′框，发现只有SNORD49A的D盒影响LNC-SNO49AB形成 (图2h)，表明只有末端的snoRNA对lnc-snoRNA的形成至关重要。因此，他们猜测在转录起始过程中，m7G先在LNC-SNO49AB 5 '端形成帽子结构，未剪接的第二内含子序列保留在pre-LNC-SNO49AB中，当外切酶到达SNORD49A的snoRNP位置时，降解被阻止了，因此在3 '端产生了一个snoRNA(图2i)。

图2

3. LNC-SNO49AB在白血病中高表达，促进癌细胞增殖

通过对15例健康对照和94例白血病临床样本的分析显示，LNC-SNO49AB在白血病中高表达 (图3a)。在19个初步诊断完全缓解(CR)的样本中， LNC-SNO49AB水平较低(图3b)，表明LNC-SNO49AB水平与白血病的进展和治疗结果相关。在多种白血病细胞中干扰LNCSNO49AB后，细胞增殖明显降低(图3c)，细胞周期阻滞(图3d)，集落生成明显受损(图3g) ，其他靶点siRNA和寡核苷酸干扰的结果类似(图3e)。LNC-SNO49AB过表达的效果相反。在白血病小鼠模型中(图3j)，干扰LNC-SNO49AB导致异种移植肿瘤的脾脏大小和重量减少(图3k)，RS4;11细胞在血液、骨髓、脾脏和肝脏中的浸润也急剧减少(图3i) ，且LNC-SNO49AB干扰小鼠有更好的生存结果(图3m)。以上体外和体内实验结果均表明LNC-SNO49AB促进白血病发展。

图3

4. LNC-SNO49AB在核仁中与ADAR1相互作用

LNC-SNO49AB在白血病中的作用机制是什么呢？CRISPR-Cas13系统的RNA成像(图4a)和亚细胞组分分析(图4b)结果显示，LNC-SNO49AB主要位于细胞核，尤其是核仁。两次独立的RNA pull down结合质谱（MS）分析实验寻找了LNCSNO49AB的潜在结合蛋白。在质谱鉴定到的蛋白质中，一种位于核糖体中的RNA编辑酶ADAR1引起了注意。RNA pull down WB和RIP-qPCR实验进一步验证了ADAR1与LNC-SNO49AB的相互作用（图4d）。此外，体外转录的LNC-SNO49AB可以与纯化的Flag-ADAR1蛋白结合(图4e)。免疫荧光显示ADAR1与LNC-SNO49AB共定位于核仁中 (图4f)。这些数据表明LNC-SNO49AB直接与ADAR1结合。

已知ADAR1包含3个主要结构与，对哺乳动物RNA”A到I”编辑至关重要。RNA pull down实验表明ADAR1的dsRBD结构域的缺失强烈破坏了ADAR1与LNCSNO49AB的相互作用(图4h); RIP分析显示dsRBD对LNC-SNO49AB具有高亲和力(图4i)，并且截短的ADAR1片段有三个dsRBD有效地结合在LNC-SNO49AB上(图4j, k)。在dsRBDs中，RI的缺失显著降低了ADAR1与LNC-SNO49AB之间的相互作用，而RII和RIII结合LNCSNO49AB的效率较低(图41,m)，表明ADAR1中dsRBDs的RI对LNC-SNO49AB的结合至关重要。RIII的缺失减少了ADAR1与已知RNA编辑底物的结合，但不太影响与LNC-SNO49AB的结合 (图41)。

图4

5. LNC-SNO49AB促进ADAR1二聚化

ADAR1的RNA编辑活性依赖于其同源二聚化(图5a)。免疫共沉淀（Co-IP）结果显示Flag-ADAR1与HA-ADAR1相互作用(图5b)，删除Flag-ADAR1的dsRBD损害了这种相互作用(图5c)，表明dsRBD在二聚化中起关键作用。假设LNC-SNO49AB可能通过结合dsRBD影响ADAR1的二聚化，研究人员在293T细胞中同时过表达FLAG-ADAR1、HAADAR1和LNC-SNO49AB，HA-ADAR1的CoIP实验显示FLAG-ADAR1和LNC-SNO49AB均显著富集(图5d)。此外进行了两步RIP实验，第一步flag抗体和第二步HA抗体的RIP都同时捕获了FLAG-ADAR1、HA-ADAR1和LNC-SNO49AB (图5e)，表明LNC-SNO49AB和二聚体ADAR1形成了复合体。截短LNC-SNO49AB序列(图5f)进行的RNA pull down实验结果显示，每个截短的LNC-SNO49AB片段都与ADAR1相互作用(图5g)，表明LNC-SNO49AB序列中包含多个ADAR1结合位点。他们接着探索LNC-SNO49AB是否影响ADAR1的二聚化。Co-IP结果显示，干扰LNC-SNO49AB降低了FLAG-ADAR1与HA-ADAR1的结合，过表达则增加了它们间的相互作用 (图5h, i)，表明LNC-SNO49AB稳定了ADAR1二聚化。双荧光素酶报告基因实验研究了LNC-SNO49AB是否影响ADAR149的活性(图5j)。在hRLuc起始密码子后插入一个终止密码子，该序列可以被ADAR1识别，当进行”A到I”编辑时，终止密码子UAG会变成UIG，使hRLuc恢复翻译，结果显示LNC-SNO49AB过表达比对照组产生了更多的hRluc(图5k)。这些数据表明LNC-SNO49AB通过促进ADAR1的二聚化来提高ADAR1的活性。

图5

6. LNC-SNO49AB的致癌作用部分取决于其对ADAR1活性的调节

为了确定LNC-SNO49AB是否通过促进ADAR1的RNA“A到I”编辑效率来发挥其致癌作用。作者在白血病细胞中干扰LNC-SNO49AB，转录组分析结果显示RNA “A到I”编辑整体下降 (图6a,b)，并且si-ADAR1组384个失调基因中有162个也存在于si-LNC-SNO49AB组中(差异倍数> 2, FDR < 0.05)(图6c)。GO富集分析表明差异基因主要参与细胞周期、Hippo信号传导和脂蛋白代谢过程(图6d)。敲低LNC-SNO49AB或ADAR1可显著调节这些潜在靶基因的表达，进一步表明SNO49AB和ADAR1在有相似的调控作用(图6e)。此外，在白血病细胞中干扰ADAR1会导致细胞周期阻滞(图6f)和克隆生长受损(图6g)，而ADAR1的过表达很大程度上挽救了LNC-SNO49AB敲低的效果(图6h)。

图6

● 结论：

LNC-SNO49AB通过增强ADAR1介导的RNA“A到I”编辑来促进白血病进展（图7）。

图7