在过去的几十年中，定量蛋白质组学一直是生物学研究中的一个前沿且要求很高的领域。  随着技术的进步，基于 MS（质谱）的方法已成为非常有用的工具，它利用碎片化合物的质荷比与其离子丰度成比例。  MS 将结果作为化合物的离子丰度与其质荷比的关系图提供，随后提供有关化合物的性质、可能的结构和性质的信息。   这种化合物可以是任何蛋白质、翻译后修饰、生物活性分子等。蛋白水解肽的 MS 响应可能由于其不均匀的物理化学性质（例如疏水性、偶极矩、大小、电荷、质量等）而有所不同。因此它成为一种剧烈运动以准确量化同一 MS 分析中不同测试样品之间生物分子相对丰度的变化。  为了解决这个缺陷，在通用 MS 协议中引入了一种新的修改，称为 SILAC（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记），它允许将氨基酸的稳定同位素插入蛋白质或肽中。  SILAC 能够在同一 MS 运行中对来自不同测试样品的这些分子进行相对和可比较的量化，最终最大限度地减少由 MS 仪器在不同运行中造成的样品注入和离子抑制导致的结果的错误变异性。

SILAC实验技术于2002 年首次引入，作为南丹麦大学实验生物信息学中心 (CEBI) 的一种代谢标记技术。  准确地说，在活细胞的生长培养基中使用了稳定的同位素标记的氨基酸，随后可以对不同实验条件下的细胞蛋白质组学进行广泛比较。

SILAC实验的原则

SILAC 主要基于稳定同位素标记的氨基酸（例如含有 13 C 或 15 N 的精氨酸或赖氨酸）在活细胞培养物中的代谢结合。 有两种细胞群被选择并在两种不同的培养基中生长； 一个群体的“轻培养基”基本上包含含有天然同位素的氨基酸，而另一个群体则用包含稳定同位素标记的氨基酸的“重培养基”喂养。

SILAC 背后的关键原理是随着细胞分裂次数的增加代谢活动增加，随后氨基酸在蛋白质组中的掺入增加。 随着分裂次数的增加，蛋白质达到重状态，所有蛋白质都含有标记的氨基酸。 虽然，标记效率会根据蛋白质周转率（蛋白质合成与降解）进行预先优化。 在确保完全标记（等于或 > 95% 的标记效率）后，可以对细胞群进行操作，然后从等量的标记和未标记细胞群中提取总蛋白质。 将蛋白质样品探测到基于胰蛋白酶的消化形成肽。 最终，消化的肽可以在 LC-MS/MS 仪器上进行分析。 结果的量化基于同位素标记肽与未标记肽的比率。 来自标记和未标记样品的信号强度允许进行定量比较。

对于进行 SILAC 实验，氨基酸的选择非常关键。  在理想条件下，这些氨基酸应该是培养系统中细胞存活所必需的一种氨基酸，以确保所选氨基酸的唯一来源来自培养基，例如亮氨酸、赖氨酸和蛋氨酸。

如今， 13 C 或 15 N 标记的精氨酸和赖氨酸的组合用于重培养基中，因为在下一步蛋白质组学分析中使用的蛋白水解酶胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸残基的羧基末端特异性切割。因此，SILAC 标记与重赖氨酸和精氨酸的组合以及胰蛋白酶消化的组合提供了对蛋白质中除 C 端以外的大多数胰蛋白酶肽的更大程度的定量，最终达到更高的蛋白质组定量效率。

SILAC实验多重比较水平

SILAC 实验可以通过两个或多个比较级别（plex）进行。  大多数实验比较了两种不同的细胞条件。  然而，随着精氨酸和赖氨酸三种同位素不同形式的可用性，也可以进行三个级别的比较。最近，由于多级比较的广泛优势，5-plex SILAC 实验可用于五种同位素不同形式的精氨酸。  尽管 5-plex 系统的缺点是影响了蛋白质组的量化效率，因为只有含精氨酸的肽才能用它来量化。  为了克服这个问题，可以在相同的测试条件下进行两个 3-plex SILAC 标记。

SILAC技术实验流程-辉骏生物

SILAC技术实验服务信息-辉骏生物

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