肽和蛋白质从头测序的质谱方法

从头测序是一种分析和鉴定肽序列和一些翻译后修饰蛋白的方法。 与其他一些分析方法依赖于已知的蛋白质序列数据库或已知的质谱数据库不同，denovo 测序使用串联质谱法根据肽段的断裂特征进行直接分析。 因此，蛋白质数据库中未包含的肽序列、新物种的蛋白质序列和基因组尚未测序的蛋白质序列都可以进行分析。 该方法开发的软件包括 PepNovo、PEAKS 和 pNovo。

质谱法肽和蛋白质从头测序的基本原理

在质谱分析中，待分析物质的粒子在通过电磁场之前首先被电离。 由于不同质荷比的离子在电磁场中受到不同的作用力，它们的运动轨迹和飞行时间，能够分离和检测离子的特性是不同的。 在使用串联质谱进行肽段鉴定的过程中，肽段从头测序可以直接从二级图谱中推断出最可能的肽段序列。 找到特定的断裂模式后，可以根据质谱峰与氨基酸翻译后修饰的质量差异计算出相应的氨基酸信息。

通过质谱法进行肽和蛋白质从头测序的工作流程

蛋白质/肽从头测序的工作流程如下：

1.使用生化分级分离或亲和选择过程从样品组织中提取待分析的蛋白质。 使用相关酶（酶解），如胰蛋白酶，生成肽。

2.使用高效液相色谱分离和纯化肽消化产物。

3. 进入离子源前，用高压液相色谱分离洗涤肽段。

4. 肽通过离子源并转化为带高电荷的液滴。 脱水后进入质谱仪产生一级质谱。

5. 肽段的优先级列表由计算机生成。

6. 选择肽段进行下一轮碎裂。 通过检测电磁场中的离子运动，可以得到离子的质荷比，构成串联质谱仪；

7、质谱仪分析过程中，具有特定质荷比的肽离子通过一定质量数；

8、根据这些碎片离子的质荷比信息，可以推导出这种能量轰击裂解，通过排列组合推导出相应的肽段氨基酸残基，从而解析出相应的肽段序列到质谱；
9. 软件用于分析每个肽的二级质谱峰。 拼接肽段序列，获得全长蛋白质序列。

图 1. 质谱法肽从头测序的过程（Hao, et al . 2019）。

图 2. HPLC 与质谱联用的 de novo 测序过程

多肽和蛋白质从头测序的质谱应用

部分应用包括生物样品中未知肽序列的分析检测、末端残基缺失肽的检测、赖氨酸和亮氨酸的鉴定、N-末端封闭和环状蛋白的鉴定、未知蛋白质或肽序列信息的准确测定，以方便未知蛋白质的功能研究，商业修饰蛋白质和酶的序列的准确测定，稳定细胞系中表达的蛋白质序列的准确测定，抗体一级结构序列的单克隆分析等。

目前，最常用的蛋白质序列分析技术是质谱法。质谱法是一种用于准确测定和表征蛋白质的高效方法。蛋白质经过消化酶预处理后被消化成小碎片，然后通过质谱仪进行分析。 根据项目需要，MALDI 和 ESI 是两种用作电离肽片段的电离源。 通常，在处理大量样本时，更频繁地使用 MALDI。 然后通过分析每个片段的质谱获得肽序列，这些片段共同构成全长蛋白质序列。

作为国内领先的生物技术公司之一，辉骏生物专业提供准确的质量测定。 基于核磁共振和质谱技术平台，我们保证为客户提供可靠高效的质谱鉴定研究服务，以符合广大客户的研究目标。

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参考
1. Aebersold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature, 2003,422(6928):198-207.
2. Hao Yang, Yan Chang Li, Ming Zhi Zhao, et al. Precision De Novo Peptide Sequencing Using Mirror Proteases of Ac-LysargiNase and Trypsin for Large-scale Proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP, 2019.
3. Medzihradszky K F, Chalkley R J. Lessons in de novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2013, 34(1).
4. Marshall Bern, Yuhan Cai, David Goldberg. Lookup Peaks: A Hybrid of de Novo Sequencing and Database Search for Protein Identification by Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2007, 79(4):1393-1400.