中文标题：在mir-181a/PPFIA1信号通路中发现致癌的PARP1，或成为BCR-ABL的靶点并有着潜在的治疗作用

发表期刊：Mol Ther Nucleic Acids

中科院分区：1区

影响因子：10.183

发表时间：2019年

合作单位：暨南大学医学院

运用技术：SILAC、免疫共沉淀（Co-IP）（由辉骏生物提供技术支持,点击查看服务详情）

● 研究背景

慢性粒细胞白血病(CML)是一种克隆性骨髓增生性疾病，每10万人中约有1-2人，占成人白血病总数的15%。MIR-181a在白血病中表达下调，并影响其进展、耐药性和预后，然而，其靶点在白血病，特别是慢性粒细胞白血病(CML)中的确切作用机制尚不清楚。

● 研究结果

1. MiR-181a在CML中的直接靶基因是PPFIA1

qPCR首先检测了miR-181a在健康血细胞、人类CML样本和CML细胞系中的表达水平。结果显示，miR-181a在人CML样本和CML细胞系中的水平较低(图1A)，表明miR-181a的下调可能在白血病发生有关。因此，研究者采用SILAC蛋白组学和基因芯片技术联合分析了miR-181a过表达对CML细胞株K562的影响(图1C)，结合miRNA靶基因预测，确定了15个候选的miR-181a靶基因。其中，PPFIA1被选作进一步分析(图1D-E)。qRT-PCR和WB检测分别确定了PPFIA1基因和蛋白水平在miR-181a过表达的K562细胞中下调(图1F)。接下来，研究者采用双荧光素酶报告基因实验来验证PPFIA1是否为miR-181a的靶基因。在293T细胞中，miR-181a转染可显著降低PPFIA1-3'UTR的荧光素酶活性，但对3'UTR的突变序列没有作用(图1G)。这些结果表明，PPFIA1是K562细胞中miR-181a的直接靶点之一。

图1

2. PPFIA1或miR-181a在慢性粒细胞白血病恶性进展中的作用

接下来，研究者检测了PPFIA1在疾病和对照样本中的表达水平，发现PPFIA1在白血病细胞或组织样本中表达较高(图2B)。MTT实验发现MiR-181a过表达和PPFIA1干扰均以浓度依赖的方式增加了K562细胞对IM处理的敏感性(图2A)；Transwell分析和克隆形成实验也表明，miR-181a过表达或PPFIA1干扰显著降低了CML细胞的侵袭能力(图2B)和细胞集落形成能力(图2C)。当在K562细胞中过表达PPFIA1后，MTT、Transwell细胞侵袭和克隆形成实验结果显示，PPFIA1显著抑制了IM对K562细胞的杀伤作用，细胞活力增加(图2D)，增强了细胞侵袭力(图2E)，增加了细胞集落数(图2E)。这些结果表明，PPFIA1和miR-181a的表达水平与K562细胞的恶性表型相关。

图2

3. PPFIA1 siRNA对CML异种移植小鼠模型的抑制作用

为了探讨PPFIA1-siRNA的治疗潜力，研究者将106个荧光素酶标记的K562细胞注射到NSG小鼠体内，并通过生物成像监测siRNA的治疗效果。在注射k562荧光素酶细胞5天后，NSG小鼠分别用PPFIA1-siRNA或NC siRNA对照隔天处理共7次。结果显示，与对照组相比，PPFIA1 siRNA显著抑制了K562-荧光素酶细胞的生长(图3A)；接受NC-siRNA治疗的小鼠的相对荧光素酶值从接种肿瘤时的1.58e+6上升到8.01e+8（在第21天），而接受PPFIA1 siRNA治疗的小鼠的则从1.56e+6上升到1.35e+8(图3B)。这些结果表明，PPFIA1-siRNA可以抑制K562-荧光素酶细胞在体内的生长。研究者继续分析了体重这一动物模型癌症恶病质的重要指标，接受NC-siRNA治疗的小鼠的平均体重从27.9g下降到26.4g，而接受PPFIA1-siRNA治疗的小鼠的平均体重从27.9g增加到28.4g(图3C)。接受PPFIA1 siRNA治疗的小鼠比对照组的小鼠存活时间更长(图3D)。这些结果表明，PPFIA1 siRNA可能是治疗CML的一种有前途的药物。

图3

4. 通过磷酸阵列分析检测到PPFIA1-siRNA降低KIT磷酸化水平

为了探索PPFIA1增强CML细胞侵袭性和克隆性的机制，研究者进行了磷酸阵列检测，通过计算实验组和对照组(PPFIA1-siRNA/NC和miR-181a mimic/NC)在248个特异磷酸化位点上的磷酸化比率寻找差异位点(图4A)。在miR-181a模拟转染组中，23个蛋白位点的磷酸化水平降低，其中7个位点比NC转染组降低了30%(图4B)。PPFIA1 siRNA转染降低了60个蛋白位点的磷酸化，其中8个位点降低了50%(图4C)。研究者最终确定了受miR-181a mimic和PPFIA1-siRNA处理影响的三个磷酸化靶点，KIT-Tyr721、MAPK-Tyr182和VEGFR2-Tyr951(图4D)。已知KIT与CML发病机制有关，因此他们推测miR-181a的靶点PPFIA1可能通过激活K562细胞的KIT信号通路促进恶性表型。在过表达PPFIA1的K562细胞株中，KIT-Tyr721的磷酸化水平显著增加(图4E)，而PPFIA1- siRNA则有相反效果(图4F)。这些数据表明，PPFIA1可能通过激活CML中的KIT通路而发挥致癌作用。

图4

5. PPFIA1和BCR/ABL的重要下游分子PARP1

为了探讨PPFIA1和KIT之间的关系，研究者在K562细胞中过表达FLAG-PPFIA1，并分别进行了BCR和FLAG抗体的免疫共沉淀(Co-IP)，对IP产物的质谱分析结果显示，PARP1蛋白同时与FLAG-PPFIA1和BCR相互作用(图5A)。分子对接分析表明，PARP1催化结构域可以与PPFIA1 (PDB: 3TAC)和ABL1 结构域(PDB: 5HU9)结合(图5B，C)，ABL1的F-actin结构域可以与PARP1的催化结构域对接(图5D)，而SH2结构域不能与PARP1的催化结构域对接。由于无法获得BCR/ABL融合蛋白，研究者纯化了ABL的每个结构域，并进行了表面等离子体共振成像（SPRi）分析，结果证实ABL1的F-actin结构域可以与PARP1结合，与分子对接分析结果一致(图5E)。此外，Co-IP WB实验也证实了与PPFIA1和ABL1相互作用的下游分子PARP1（图5F-5I）。基于这些结果，研究者推测PARP1介导了PPFIA1和KIT之间的关系。

图5

6. PARP1通过激活NF-kB-P65转录促进KIT表达

已知PARP1是NF-kB转录调节复合物的关键成分。因此，研究者推测PPFIA1通过PARP1、P65和KIT通路参与白血病的生长。与预想一致，在K562细胞中过表达PARP1可导致P65表达水平上调，而使用奥拉帕尼(PARP1抑制剂[PARPi])导致P65下调(图6A-6C)。此外，过表达P65还导致KIT的mRNA和蛋白上调，而P65- siRNA则导致KIT水平下调(图6D-6F)。这些数据表明，PPFIA1通过与PARP1相互作用参与了KIT水平的调控，而PARP1调节NF-kB和P65的转录活性。PPFIA1/PARP1/NF-kB-P65/KIT可能在CML中构成了一个调控轴。那么，靶向PARP1是否可以治疗CML呢？研究者构建了一个Baf3-P210驱动的过表达PPFIA1的白血病细胞株，发现奥拉帕尼显著抑制了PPFIA1过表达细胞的克隆形成能力(图6G)。接着，他们将该细胞移植到用3Gy X射线辐射的BALB/c小鼠中，移植小鼠连续7天单独服用奥拉帕利布或生理盐水对照。接受奥拉帕利治疗的动物比空载组的动物存活时间更长(图6H)。这些结果表明，PARP是治疗慢性粒细胞白血病的一种有前途的方法。

图6

● 结论

miR-181a在白血病特别是慢性粒细胞白血病（CML）中表达下调，并影响疾病发展、耐药性和预后。本研究通过基因芯片和SILAC蛋白组学等方法联合分析，发现PPFIA1是miR-181a的直接靶基因，并利用CoIP-MS实验发现了PPFIA1的结合蛋白PARP1，阐明其通过激活核受体kappa B(NF-kB)和P65的表达而上调KIT蛋白；抑制PPFIA1或PARP1能够下调c-KIT水平，抑制CML细胞生长，延长小鼠存活期。总的来说，该研究揭示了miR-181a/PPFIA1/PARP1/NFkB-P65/KIT的分子调节轴，并提出PPFIA1和PARP1可能是潜在的CML治疗靶点。