中文标题：香蕉果实成熟过程中淀粉降解过程的综合研究及转录激活剂MabHLH6的鉴定

发表期刊：Plant Biotechnology Journal

中科院分区：1区

影响因子：13.263

时间：2018年1月

合作单位：华南农业大学

运用技术：itraq蛋白质组学分析（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

淀粉是高等植物的主要储存碳水化合物，由葡萄糖聚合物、直链淀粉和支链淀粉组成，在质体中形成复杂的半结晶结构和淀粉颗粒。虽然淀粉降解在拟南芥叶片和谷类种子等模式系统中已经得到了很好的研究，但淀粉类水果，特别是香蕉成熟过程中的这一过程还很不清楚。一般来说，香蕉是在成熟的绿色期采收，然后在上市前由乙烯或乙烯释放化合物启动成熟。在成熟过程中，果皮颜色从绿色变为黄色，果肉变软。到目前为止，已经报道了几个与香蕉成熟过程中淀粉到糖的转化有关的基因，但对其调控网络的全面了解还不够深入，尤其是转录因子(TF)介导的调控机制。

● 研究结果

1.     三种不同成熟行为香蕉成熟参数的变化

首先，研究者测定了香蕉果实在自然成熟、乙烯诱导和1-甲基环丙烯(1-MCP)延迟成熟条件下的乙烯生成量和果实硬度等重要成熟参数(图1A)。结果如图1B所示，自然成熟果实贮藏15天后乙烯释放量显著增加，第18天达到最大值，之后下降；果实硬度在贮藏第18天开始下降，第23天达到最低值。乙烯处理促进了香蕉果实的成熟，表现为第1天乙烯产生提前，第3天果肉硬度急剧下降。相比之下，1-MCP处理延缓了香蕉果实的成熟和乙烯产生，果肉硬度下降，乙烯产量在第30天达到峰值(图1B)。香蕉果实成熟过程中淀粉向糖的转化与不可食向可食的转化有关，麦芽糖和葡萄糖是淀粉降解的产物，自然成熟果实的淀粉含量到第15天下降，到第23天下降到4%，可溶性糖含量相应增加(图1B)。在乙烯处理和1-MCP处理的果实中，淀粉含量的下降和可溶性糖(麦芽糖和葡萄糖)的增加表现出与它们的成熟行为相似的模式(图1B)。这些数据表明，淀粉到糖的转化与香蕉成熟过程中果实的软化和乙烯的产生是一致的。

图1

2. 香蕉生果和熟果中淀粉粒的形态

图2显示的扫描电子显微镜(SEM)分析表明，未熟和成熟香蕉果实中淀粉粒的形状和大小有明显的差异。青香蕉的淀粉颗粒表面光滑(图2C-E)，而成熟香蕉的淀粉颗粒表面有明显的平行凹槽，表明淀粉降解(图2H-J)。

图2

3. 香蕉果实成熟过程中淀粉降解相关基因在果肉中的表达模式

研究者基于香蕉基因组序列和NCBI数据库共鉴定了38个编码淀粉降解相关酶的基因，这些基因包括编码葡聚糖水双激酶(MaGWD1、MaGWD2、和 MaPWD1）、磷酸葡聚糖磷酸酶(MaSEX4、MaLSF1和MaLSF2)、β-淀粉酶(MaBAM1-MaBAM11)、α-葡聚糖磷酸化酶(MaPHS1和MaPHS2)、歧化酶(MaDPE1和MaDPE2)、麦芽糖过量蛋白(MaMEX1和MaMEX2)和质体葡萄糖转运蛋白(MapGlcT1、MapGlcT2-1、MapGlcT2-2、MapGlcT4-1和MapGlcT4-2)。

研究中首次报道了15个基因，包括MaGWD1、MaGWD2、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaLSF2、MaDPE1、MaDPE2、MaMEX1、MaMEX2、MapGlcT1、MapGlcT2-1、MapGlcT2-2、MapGlcT4-1和MapG1CT4-2。如图3所示，在三个不同处理的成熟过程中，27个基因(MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaLSF2、MaBAM1MaBAM4、MaBAM6-MaBAM8、MaBAM10、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3、MaPHS2、MaMEX1、MaMEHS2)的转录本随着乙烯产量的增加而显著增加。而MaGWD2、MaAMY2A、MaBAM9、MaPHS1、MaDPE1、MaDPE2和MapGlcT1的转录本减少。

图3

4. ITRAQ鉴定淀粉颗粒表面结合的淀粉降解相关蛋白及其积累

为了检测香蕉成熟过程中淀粉粒结合蛋白的变化，研究者从未成熟和成熟香蕉果实的淀粉粒中分离出淀粉粒结合蛋白(图4A)，然后使用iTRAQ定量蛋白质组学方法进行检测。结果如图4B所示，在淀粉颗粒表面鉴定出18个与淀粉降解相关的候选蛋白。其中，除MaGWD2和MaPHS1外，MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaBAM4、MaBAM7、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3和MaISA3在成熟果实中的积累与其转录本水平相当。MaAMY2A、MaISA1、MaDPE1和MaDPE2表达下调，而MaGWD2、MaLSF2、MaISA2和MaPHS1表达变化不大。据报道，AtGWD1在拟南芥叶片的短暂淀粉降解中起重要作用，因此选择AtGWD1的同源物进行进一步研究。WB分析结果(图5B)表明，在香蕉的成熟阶段，天然的、乙烯诱导的或1-MCP诱导的延迟成熟都能显著诱导MaGWD1蛋白的表达(图5C)。

图4

图5

5. AMaGWD1启动子相互作用蛋白MabHLH6的鉴定

为了研究MaGWD1的潜在调控作用，研究者分离了MaGWD1启动子，并用GUS报告基因(图6A)进行了瞬时表达实验。结果显示，在MaGWD1启动子驱动下转染GUS报告基因的香蕉果肉中，在乙烯处理的果肉中观察到GUS信号(图6B)。然后以MaGWD1启动子为诱饵，进行酵母单杂交文库筛选。经过高精度筛选，获得了一个编码bHLHTF的基因，命名为MabHLH6(XP_009408340.1)，。酵母单杂交实验进一步证实了MabHLH6和MaGWD1启动子之间的相互作用(图6C，D)。

图6

6. MabHLH6的分子表征

与MaGWD1相似，MabHLH6的表达与淀粉降解和果实成熟呈显著正相关，在天然香蕉、乙烯诱导香蕉和1-MCP延迟成熟香蕉中，MabHLH6的表达水平分别在第18天、第5天和第40天达到最高水平(图7A)。同时，其启动子活性在瞬时表达实验中被乙烯诱导(图7B)。此外，WB分析结果(图7C)显示，MabHLH6蛋白在成熟阶段也增加，与果肉硬度和淀粉含量的下降相平行(图7D)。

图7

7. MabHLH6通过直接与其启动子结合来激活编码淀粉降解相关酶的基因的表达

众所周知，bHLH转录因子优先与其目标启动子的E-box(CANNTG)基序结合。为了测试MabHLH6调节启动子(MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaLSF2、MaBAM1-MaBAM4、MaBAM6-MaBAM8、MaBAM10、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3、MaPHS2、MaMEX1、MaMEX2、MapGlcT2-1、MapGlcT22、MapGlcT2-1）等的能力，研究者进行了瞬时检测。在这些分析中，在淀粉降解相关基因启动子的控制下与LUC报告质粒以及在CaMV 35S启动子控制下携带MabHLH6的过表达载体共同转化烟草叶片(图8A)。如图8C所示，在26个启动子中，MabHLHH6能显著诱导MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3和MapGlcT2-2启动子的活性，且Luc/Ren比值相对较高。

图8

为了进一步研究MabHLH6是否与MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3和MapGlcT2-2启动子直接结合，研究者进行了电泳迁移率改变分析(EMSA)。如图9A，B所示，重组的MabHLH6蛋白能够与这11个启动子片段结合，并引起迁移率的移动。ChIP-qPCR分析进一步证实了MabHLH6与这些启动子在活体中的结合。如预期的那样，与阴性对照IgG相比，含有MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3和MapGlcT2-2启动子E-box的启动子区域显著富集(图9C，D)。这些数据表明，MabHLH6可能通过直接与其启动子的E-box基序结合，作为淀粉降解相关基因的一个子集的正转录激活因子。

图9