中文标题：泛素特异性蛋白酶3(USP3)通过与SUZ12相互作用和去泛素化促进胃癌细胞迁移和侵袭

发表期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

中科院分区：1区

影响因子：12.658

发表时间：2019年

合作单位：深圳市龙岗区人民医院消化内科

运用技术：iTRAQ蛋白质组学分析（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

泛素特异性蛋白酶3(USP3)是一种去泛素化酶，在多种生物学过程中发挥着重要作用。USP3的异常表达可能在肿瘤的发生发展中起重要作用。然而，有关USP3促进胃癌转移的研究仍然少之又少，因此，了解USP3促进胃癌转移的有关机制将为胃癌的治疗提供新的选择。

● 研究结果

1. 胃癌患者USP3表达增高与肿瘤进展及预后不良相关

为了确定USP3在胃癌侵袭性中的作用，研究者用Western blotting分析了6对胃癌组织中USP3的表达水平。结果表明，USP3在胃癌组织中的表达与邻近的非肿瘤组织相比有显著差异(图1A)。RT-PCR法检测USP3在6种癌细胞中的表达，结果显示，与人胃上皮细胞系GES-1相比，GC细胞株AGS、BGC-823、HGC-27和SGC-7901显示USP3表达增加，而MGC-803和MKN28则没有显示出USP3表达增加（图1B）。应用组织芯片技术(TMA)分析了87例胃癌组织中USP3的表达，结果显示人胃癌组织的免疫染色较强，而正常胃组织的免疫染色较少(图1C)。临床病理分析显示，USP3的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肿瘤大小、T分期、临床TNM分期呈正相关。Kaplan-Meier法也显示USP3高表达的胃癌患者的总体存活率明显低于低USP3表达的患者(图1E)。这些结果表明，USP3可能在胃癌的发生发展中起作用。

图1

2. USP3上调促进胃癌EMT转移

细胞迁移和侵袭能力增加与癌细胞转移潜能增加有关，而与细胞增殖率无关研究者利用Transwell和划痕实验研究了USP3对MGC-803(低表达)以及AGS和BGC-823(高表达)细胞株侵袭和迁移能力的影响（图2B）。结果表明，与载体对照细胞相比，USP3的异位表达促进了GC细胞的侵袭和迁移(图2A-C)。此外，与MGC-803细胞相比，AGS和BGC-823细胞表现出更高的侵袭和迁移率(图2A-C)。接下来，研究者合成了3对USP3 siRNA，结果显示USP3的敲除可以抑制AGS和BGC-823细胞的侵袭和迁移能力(图2D，E)。这表明USP3的高表达可能通过促进胃癌细胞的侵袭和迁移能力而参与胃癌的转移。研究者还研究了GC细胞的形态特征。观察显示转染USP3的细胞发生了显著的形态变化，呈现出EMT过程中产生的成纤维细胞的典型特征(图2F)。免疫荧光和WB分析显示，上皮标志物E-cadherin在USP3转染细胞中的表达显著降低，而间充质标志物vientin(与EMT呈正相关)在USP3转染细胞中的表达显著上调(图2G，H)。一些研究表明，参与Erk1/2/Akt信号转导的磷酸化水平蛋白已成为EMT的中心特征，在许多肿瘤模型中，EMT是肿瘤转移的初始步骤。为此，研究者进行了WB实验以分析蛋白质的磷酸化状态。结果显示，在USP3过表达的细胞中，AKT和ERK1/2的磷酸化水平升高，而p-AKT和ERK1/2的水平降低了siRNA介导的USP3在GC细胞中的下调。这些结果表明，USP3的过表达可能通过诱导EMT过程促进胃癌的侵袭和转移。

图2

3. Usp3在TGF-β1诱导的胃癌细胞内皮细胞转化和细胞迁移中的作用

已有报道表明，TGF-β可诱导胃癌细胞发生内胚层转化。为了研究TGF-β是否影响USP3的表达，研究者首先检测了TGF-β处理的BCG-823细胞中USP3的表达水平。结果显示，TGF-β处理后USP3的表达显著增加，且呈剂量和时间依赖性。此外，TGF-β1显著抑制EMT标志物Ecadherin的表达。然而，用USP3 siRNA预先转染细胞不仅抑制了USP3的表达，也抑制了TGF-β1诱导的vimentin 的表达。这些结果表明，USP3参与了TGF-β诱导的EMT过程。

4. USP3促进EMT和体内转移

通过裸鼠尾静脉注射实验观察USP3对胃癌转移的影响，与对照细胞相比，USP3过表达细胞组在肺部形成了各种大的转移结节(图3A)，侵袭能力也显著增强(图3B)。组织学分析证实BGC-823细胞存在肺转移(图3C)。qPCR分析结果显示，与对照细胞相比，USP3过表达的细胞导致E-cadherin的表达显著降低(图3D)。这些发现表明，USP3的异位表达参与了胃癌细胞的EMT过程和转移的调控。

图3

5. USP3对胃癌细胞SUZ12蛋白表达的影响

研究者通过iTRAQ实验分析了稳定表达FLAG-USP3融合蛋白的BGC-823细胞和携带空载体的BGC-823细胞的总蛋白。鉴定出5631种蛋白质用于进一步的定量分析。其中，当USP3基因异位表达时，SUZ12表达上调。qPCR分析表明，USP3的过表达或敲除均对SUZ12的mRNA水平没有影响(图4A)。然而，USP3上调时内源性SUZ12表达增加(图4B)，USP3降低时内源性SUZ12表达减少(图4C)，这表明USP3对SUZ12表达的调控只发生在转录后水平。激光共聚焦扫描显微镜观察了USP3和SUZ12的定位，结果显示这两种蛋白在GC细胞中定位于相同的区域，它们主要分布在细胞核，少量分布在细胞质中(图4D)。这些发现表明，USP3应该是胃癌细胞中SUZ12的一个强有力的调节因子。

图4

6. USP3与SUZ12相互作用并使其去泛素化

研究者将USP3和Myc标记的SUZ12载体共转染GC细胞，以阐明USP3对SUZ12的作用机制。结果显示，FLAG标记的USP3可以与Myc标记的SUZ12在GC细胞中免疫共沉淀(图5A)。CoIP实验进一步表明，USP3可以与SUZ12相互作用(图5B)。为了解决USP3是否以及如何稳定SUZ12的问题，研究者用放线菌酮处理了vector和表达USP3的BCG-823细胞(图5C)。结果表明，USP3通过抑制蛋白质降解提高了SUZ12的稳定性。在BCG-823细胞中转染FLAG标记的USP3或空载体质粒，WB分析显示，USP3的表达强烈地抑制了SUZ12的泛素化(图5D)，而抑制USP3的表达则导致了相反的结果(图5E)。这些发现表明，USP3是一个通过与SUZ12相互作用和去泛素化来控制SUZ12蛋白水平的DUB。

图5

7. SUZ12参与USP3诱导的GC细胞迁移、侵袭和EMT

为了探讨USP3、SUZ12与细胞迁移和侵袭能力的关系，研究者通过siRNA 下调了SUZ12在GC细胞中的表达(图6A)。结果表明，转染SUZ12 siRNA 的GC细胞的迁移和侵袭能力显著减弱(图6B，C)。研究者进一步研究了SUZ12是否通过调节USP3的表达来影响EMT过程。在显微镜下，在USP3细胞中敲除SUZ12后恢复了正常的表型(图6D)。采用IHC法检测淋巴结转移组织中USP3和SUZ12的表达，发现USP3和SUZ12在两例患者癌细胞的胞核和胞浆中高表达(图6E)。此外，WB分析结果表明，在USP3过表达的细胞中，SUZ12的敲除增加了上皮标志物Ecadherin的表达，但降低了间质标志物vientin、Snail和MMP9的表达(图6F)。这些数据表明，USP3-SUZ12轴促进了GC细胞的EMT样表型。

图6

8. USP3和SUZ12在胃癌细胞和癌组织中的表达呈正相关

为了进一步研究USP3和SUZ12之间的关系，研究者分析了USP3和SUZ12在胃癌细胞和组织中的表达。结果表明，大多数GC细胞中USP3和SUZ12的蛋白水平呈正相关(图7A)。免疫组织化学染色显示，USP3和SUZ12阳性信号在10例胃癌标本的癌细胞中均呈强阳性或中等阳性表达(图7B)。癌组织和正常胃组织中USP3和SUZ12的表达谱与上皮标志物E-cadherin的表达谱呈负相关(图7B)。此外，Spearman等级相关分析证实，USP3蛋白与SUZ12蛋白在人体组织中的表达呈正相关(图7C)，USP3和SUZ12蛋白水平与Ecadherin蛋白水平呈负相关(图7D)。这些结果表明，USP3和SUZ12的表达水平呈正相关，USP3/SUZ12和E-cadherin蛋白的表达水平呈负相关。

图7