分子克隆是一种用于创建在细菌或哺乳动物细胞中表达的 DNA 实验工具的技术， 分子克隆被定义为目标 DNA 序列的分离和扩增。

什么是分子克隆？

分子克隆实验是一种将外源 DNA 片段插入能够在宿主细胞中自主复制的载体的技术。 这种宿主细胞通常是一种细菌（ 大肠杆菌 ）。 插入 DNA 的多个拷贝的产生可用于多种目的。

基因调取及合成，分子克隆，cdna克隆服务，辉骏生物自有细胞实验平台，克隆实验包含：从细胞或组织中提取总DNA或总RNA后扩增出目的基因;通过化学合成的方法获得目的DNA序列。交付产物：含目的基因的质粒和和甘油菌，原始测序文件和拼接文件等，2-4周可得实验周期短，实验结果完美。

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分子克隆的要求

要进行克隆实验，需要几种材料。  这些包括靶DNA、宿主生物、用于克隆的载体DNA、将外源DNA插入载体的方法、将体外修饰的DNA放入宿主细胞的方法，以及选择和/或筛选细胞的方法携带插入的外源 DNA。

参与分子克隆的酶

有三种类型的酶用于克隆。 这些包括限制性内切酶、聚合酶、核酸酶、连接酶、激酶和磷酸酶。切割双链 DNA 核酸 分子的识别位点处或附近称为限制性位点 。

大多数插入的片段是由于用称为限制酶的酶消化现有的 DNA 片段而产生的。结果，产生了约 100 个碱基对长度的短插入片段，这些短插入片段也可以在商业上合成为单链寡核苷酸，然后退火形成双链片段。

聚合酶是催化 DNA 或 RNA 聚合物合成的酶，其序列与原始模板互补。DNA 核酸酶 的断裂或裂解 磷酸二酯键 之间存在脱氧核糖 和 DNA 链主链中的磷酸残基外切核酸酶是在 DNA 末端附近切割的核酸酶； 那些在 DNA 链 称为 核酸内切酶 。这些不需要用于切割的游离 DNA 末端， 一些酶具有这两种活性。

连接酶形成磷酸二酯键以连接两段 DNA；  他们利用的是在镁离子存在下的三磷酸腺苷 (ATP)。  激酶从供体分子转移磷酸基团，而磷酸酶催化磷酸残基的去除。

载体 DNA 的选择

起分子载体作用的 DNA 分子称为载体。  它们将感兴趣的 DNA 携带到宿主细胞中并促进其复制。  克隆中使用了三种类型的载体：

1、用于克隆 DNA 小片段的质粒，大约 10 到 15 kb

2、噬菌体 gamma：用于克隆更大的 DNA 片段（~20kb）

3、粘粒：这些质粒含有来自噬菌体 gamma 的 DNA 序列，用于克隆更大的片段（最长 45kb）

在分离目标 DNA 序列后，将该插入片段定位到载体质粒以产生构建体，该质粒是可在细菌细胞如大肠杆菌中繁殖的双链环状 DNA 片段。  在实验室中，载体通常是天然存在的质粒的较小版本，具有以下几个特征：

1、复制起点

2、报告基因，通常是耐药基因

3、使 DNA 片段易于插入的独特限制位点。   这些限制性位点通常聚集在多接头区域或多个克隆位点中，这使研究人员能够为多个插入片段选择最方便的限制性酶组合。  限制性内切酶可以在特定目标处切割 DNA。  限制性内切酶的选择被认为是设计克隆策略时的关键步骤。  有几个在一处切断双链 DNA，形成平端。   其他形式的限制酶允许在猫的位点有少量碱基突出。  这些被称为互补的粘性末端，因为它们可以很容易地相互定位，从而提高了连接反应的效率。   这随后增加了成功克隆事件的机会。  对限制性内切酶组合的深思熟虑可以控制插入片段的插入方向，这对许多应用至关重要

分子克隆策略

分子克隆有四个基本步骤：

1、由于多个克隆位点的限制性消化导致载体线性化。

2、将所需或目标 DNA 片段连接到细菌质粒中：连接是将 DNA 插入载体的方法。  连接反应的要求包括两个或多个 DNA 片段（钝的或粘性的）、含有 ATP 的缓冲液和 DNA 连接酶

3、将此构建体转化为载体，如 大肠杆菌 ：这是将体外修饰的 DNA 放入宿主细胞的方法。 在转化过程中，细菌细胞会吸收裸露的 DNA 分子。 在此之后，细胞变得“有能力”，也就是说，可以接受 DNA 周期以实现这种细胞，然后用冰冷的氯化钙处理并随后进行热休克。 平均 7 到10 8 每微克DNA -3 。 转化效率定义为用于转化细菌的每微克 DNA 的菌落形成单位 (CFU) 数。 在此之后，发生 DNA 电穿孔进入宿主细胞。 这是电场介导的膜透化的一种形式； 在存在 DNA 的情况下施加高强度电场。

4、筛选阳性连接事件的存在：这是一种选择携带插入 DNA 的细胞的方法。  是指应用促进携带载体或载体并插入的细胞生长的条件。  最常见的这些筛选方法包括选择抗生素抗性、检查营养需求、使用 β-半乳糖苷酶进行蓝白选择、非常特定类型的筛选，例如使用杂交。  筛选允许细胞生长并测试生成的克隆是否存在插入片段。

在典型的 DNA 克隆程序中，将感兴趣的 DNA 片段（最常见的是所需的人类蛋白质）插入构建体中。  这些 DNA 构建体包括一个启动子元件（启动或关闭基因所需的 DNA 序列），它连接到报告基因或受启动子控制的互补 DNA 序列。

报告基因是一种产生分子的基因，该分子在转染后易于分析，该过程涉及将 DNA 或其他核酸引入真核细胞中，并可用作筛选成功转染的标志物。

总之，分子克隆涉及载体的制备，“转化”是任何载体，通常是病毒或质粒，用作载体将 DNA 序列携带到宿主细胞中，作为分子克隆程序的一部分。