基因组编辑：概述

基因包含编码生物细胞中蛋白质所需的信息。  编辑基因是研究活生物体代谢和生理过程的遗传基础的基石。  多年来，科学家为此目的使用了许多技术，特别是用于研究具有工业或科学价值的细菌，例如自杀质粒。

其他原核生物基因组编辑方法包括 lambda Red 系统和 ClosTron 方法。  传统的微生物基因组编辑技术已被证明是缓慢而费力的。

传统基因组编辑方法的缺点之一是必须将抗性标记盒引入微生物基因组，这不适合更精确的编辑，例如单氨基酸突变。  需要几个步骤，包括同源重组和切除不必要的 DNA 区域。  基因组操作会留下干扰下游基因工程的残余物。  这些缺点促进了对更好方法的需求。

CRISPR-Cas

CRISPR-Cas 是一项极大地改变了基因组编辑方式的技术。  这项技术已经存在了不到二十年，但已经在生物化学、微生物学、药物开发和食品工业等多个领域得到广泛应用。  该技术为为特定目的定制微生物开辟了强大的可能性。

CRISPR 是一种比传统 DNA 编辑方法更快、更便宜、更准确的技术。  它使科学家能够通过删除、添加或更改特定的 DNA 部分来编辑基因组的特定部分。

该系统使用两个关键分子将突变引入 DNA。  这些是一种称为 Cas9 的酶，它在特定位置切割双链 DNA 以插入新的遗传链，并引导 RNA (gRNA)。gRNA 是预先设计的 RNA 序列，通常包含大约 20 个碱基对长度在较大的 RNA“支架”内，它将 Cas9 蛋白引导至目标 DNA 序列进行编辑。  gRNA 具有与目标 DNA 序列互补的碱基。

Cas9 酶切割两条 DNA 链并将 RNA 序列插入遗传密码的目标区域。  细胞识别出DNA受损并用新的DNA序列修复它。  因此，细胞的遗传密码被 CRISPR-Cas9 系统改变，并且可以制造新一代细胞，表达编辑的遗传密码并为多种目的制造新蛋白质。

Cas基因的功能

Cas（CRISPR相关）基因常见于细菌和古细菌中。  它们充当识别外源 DNA 的一种方式，本质上，CRISPR/Cas 系统是一种原始免疫机制。  迄今为止，已鉴定出多个 Cas 基因，其中 Cas9 是 CRISPR-Cas 技术中使用最多的基因。

微生物基因组编辑：CRISPR-Cas9 及其他

虽然 CRISPR-Cas9 由于其简单性和成本优势已被广泛用于编辑真核细胞，但该系统不太适合细菌基因组编辑。  这是由于该技术仍然存在的挑战。  已经开发了多种基于 CRISPR-Cas9 的方法来克服因使用的质粒数量和特定诱导 DNA 修复机制等因素而变化的挑战。

用于微生物基因组编辑的 CRISPR-Cas9 方法的主要缺点之一是细胞毒性。 这是由于工程微生物中 Cas9 的过度表达（这是 大肠杆菌 ，但也发生在其他细菌物种中）并导致缺乏菌落。 即使没有核酸酶活性也会发生这种情况。 此外，Cas9 错配可导致微生物基因组内脱靶位置的双链断裂。

已经开发了 CRISPR-Cas 介导的微生物基因组编辑的替代策略，以克服该系统的这些缺点。  其中包括无痕 Cas9 辅助重组、诱导重组酶、在质粒中编码 DNA 修复模板、使用诱导型启动子、CRISPR 样 DNA 切口酶的核酸酶、内源性 CRISPR 系统，以及使用腺嘌呤脱氨酶等碱基编辑器。

最近探索的另一种替代方法是使用预制的核糖核蛋白 (RNP) 复合物来传递 CRISPR-Cas 机器，而不是使用质粒。 这种方法用途广泛。 这种方法的一个优点是它不依赖于微生物翻译和转录机制，并功效通过核酸酶测定预先 RNP 复合物在使用后降解，避免了 Cas9 的过度表达。

微生物基因组编辑是一种为医药、食品和工业化学品生产等行业量身定制多种重要产品的强大方法。  许多传统的基因组编辑方法费力、昂贵、耗时，并且具有一定程度的不准确性。CRISPR-Cas 已成为编辑真核和原核细胞基因组的核心技术，但仍存在阻碍其广泛应用于微生物基因组编辑的挑战。  这些挑战目前正在通过研究替代策略来解决，尽管它仍然是一项新技术，使用这些方法来工程微生物的未来是有希望的。