基因组革命揭示了疾病相关基因的环境。 询问蛋白质的功能更加困难。 测量蛋白质-蛋白质相互作用如何响应细胞的扰动而变化——使用化学物质或调整基因可以揭示对在特定疾病中起作用的蛋白质的见解。

量化蛋白质相互作用

蛋白质不会单独作用。它们通常与其他蛋白质一起进行切片和切块并催化反应。了解这种蛋白质-蛋白质相互作用或 PPI，有助于探究一个基因的突变如何影响蛋白质如何相互“交谈”以驱动疾病。

科学家通常一次只测量一种蛋白质-蛋白质相互作用。 在一个缓慢而费力的过程中，他们抓住一种蛋白质，将其从细胞中拉出，并绘制出它与哪些蛋白质相互作用的图谱。 定量亲和纯化质谱法或 q-AP-MS 等方法可以以更高的通量测量蛋白质网络在其天然环境（细胞）内的变化。

在其基本形式中，q-AP-MS 的工作原理如下：细胞（或整个动物）被“喂食”大量氨基酸，随着时间的推移，这些氨基酸会融入蛋白质中。  平行制备其他细胞作为阴性对照。   然后用编码待研究蛋白质的基因转染细胞；  蛋白质通常用标签进行修饰，例如 GFP，以便以后可以轻松分离。   接下来，蛋白质从细胞中切下并穿过凝胶，凝胶中含有与蛋白质标签结合的抗体。  蛋白质被切割成更小的片段，一切都通过质谱仪运行。   结果是哪些蛋白质与所选蛋白质结合的定量快照。

然而，在过去几年中，其他方法弥补了与 q-AP-MS 相关的一些缺点。 一方面，将标签融合到感兴趣的蛋白质上可以从根本上改变蛋白质的行为方式。 该方法还仅提供一个时间点细胞中 PPI 的快照，并且该方法偏向于强相互作用的蛋白质； 瞬态连接更难检测和测量。 

解决 PPI 问题

“多年来，AP-MS 实验依赖于用相对较大的荧光蛋白 GFP 和/或其异源过度表达标记蛋白质，”ChromoTek 高级科学家兼研发分析团队负责人 Christian Linke-Winnebeck 说，这是 Proteintech Group 的一部分。   “当然，虽然这种方法已经产生了很多知识，但感兴趣的蛋白质可能仍然受到庞大标签和高于正常表达水平的影响。”

这就是为什么实验室现在不使用 GFP 标记，而是使用 CRISPR 直接标记基因组中的基因，以避免干扰基因的表达水平。 3 Linke-Winnebeck 说，其他团体也在使用“分裂荧光蛋白”来标记蛋白质。 在这种情况下，“只有一小部分荧光蛋白与您感兴趣的蛋白质融合，其余部分在单独的质粒上表达，”他说。 “仅使用一个小片段使 CRISPR-Cas 内源性标记方法的工作变得更加容易，”因为使用 CRISPR 插入大基因可能很困难。

在最近的预印本中，一家德国实验室正是使用这种方法“用荧光蛋白 mNeonGreen 的片段标记人类细胞系中的 1,300 多个内源基因，”Linke-Winnebeck 说，然后分裂开细胞并使蛋白质通过一种含有高亲和力抗体片段或纳米抗体的特殊凝胶，用于 mNeonGreen，由 ChromoTek 作为 MNeonGreen-Trap 出售。  “这允许在自然环境中对 1,300 种蛋白质进行可视化和深入分析。”

为了实时跟踪 PPI，并收集超出时间快照的数据，科学家们转向了 q-AP-MS 之外的方法。 一种称为 BRET（生物发光共振能量转移），使用光来检测相互作用的蛋白质。 一种蛋白质与荧光素酶（其作用类似于电子供体）融合，而另一种蛋白质与荧光蛋白融合，作为受体。 当两者靠近时，电子从供体转移到受体，受体发出荧光。 4 该实验甚至可以在 384 孔板中平行进行，并且可以在大约两个小时内测量荧光。

这可以对 PPI 进行实时的动力学分析，从而更透彻地了解 PPI 动态以及它可能如何不同，例如，在化合物治疗之间或相关蛋白质之间的差异

“这些 PPI 方法通常用于筛选工作，以识别调节目标 PPI 的新化合物，并且可以轻松适应以更好地了解临床相关突变如何影响细胞 PPI 及其对潜在治疗干预的反应，”丹尼尔斯说。  并且“因为这些方法允许在天然细胞环境中分析蛋白质相互作用动力学，所以它们通常用于确认生化 PPI 研究的结果”——例如 q-AP-MS，它需要从细胞中去除蛋白质—— “反映了细胞内实际发生的情况。”

为了测量瞬时或微弱的蛋白质相互作用，科学家可以使用表面等离子体共振或 SPR，这是一种无标记、基于光学的生物物理方法，其中将少量配体固定在表面上，然后是结合伙伴，例如作为蛋白质，通过微流体流动系统引入。 5 当两者结合时，反射光强度的变化（由于非常靠近传感器表面的折射率变化）可用于测量结合在一起的分子的比例。 通过随时间测量，这些数据用于计算结合亲和力和结合/解离动力学。 通过灵敏度、自动化和并行流体的改进，现代 SPR 仪器每天可以例行筛选或表征 100 到 1000 次交互。

这种信息丰富的技术使我们能够获得多种类型的信息，包括亲和力（相互作用的紧密程度或治疗剂与其靶标的结合强度）、动力学（相互作用的速度）、浓度（功能活性产品的数量）

Belcher 说，这项技术对药物发现特别有用，因为可以并行筛选大型抗体库，以了解它们如何与蛋白质结合。  一旦确定了药物，SPR 还可以用于在成熟过程中精确跟踪和测量其亲和力和/或动力学。

测量 PPI 以促进临床发现

这三种方法——q-AP-MS、BRET 和 SPR——一起以令人印象深刻的细节绘制、测量和剖析 PPI。  他们还在药物发现、基础和临床研究方面迎来了一场名副其实的革命。

在一项研究中，Scripps Research 的研究人员使用串联质量标签（用于更定量和并行化质谱的化学标签）和 AP-MS 来研究称为 ATF6 的转录因子如何控制内质网并“命令”它减少数量一种淀粉样蛋白，称为 ALLC，在细胞内产生。 这一发现加强了我们对系统性淀粉样蛋白疾病的理解，例如转甲状腺素蛋白相关的淀粉样蛋白疾病。 

另一项研究使用 AP-MS 一次研究了 7,000 多种蛋白质。 研究人员采用 HEK293T 肾细胞，用 2,594 种不同的“诱饵”转染它们，并使用质谱法揭示了 7,668 种蛋白质中的 23,744 种相互作用。 7 其他团体进一步扩展了这项工作； 今年早些时候，不列颠哥伦比亚大学的一个团队在包括心脏和大脑在内的七种不同小鼠组织中绘制了超过 125,000 个 PPI。 大多数相互作用以前没有报道过。 8 他们使用了一种有点类似于 q-AP-MS 的技术，称为 蛋白质相关分析 ——哺乳动物的稳定同位素标记。

NanoBRET 也已被证明是了解癌症相关癌基因如何随着癌症发展而调整蛋白质网络的关键。 该技术用于证明与野生型 RAS 蛋白相比，NRAS 突变体与 RAS 效应蛋白 RAF1 显示出更大的相互作用亲和力。 9 研究人员证实，在不分裂开放细胞的情况下，该突变改变了对调节癌症很重要的 PPI 网络。 Daniels 说，该论文“帮助确定了侵袭性癌症病例背后的分子机制，为更好地预测 RAS 突变的生物学行为提供了又一步。”

当谈到我们这个时代的故事时，COVID-19，SPR 已被证明对于衡量候选药物与病毒相互作用的结合亲和力和动力学至关重要。 例如，去年，Regeneron Pharmaceuticals 发表了针对 SARS-CoV-2 的两种抗体（casirivimab 和 imdevimab）的结合动力学 10 ； Belcher 表示，它们是世界卫生组织推荐的单克隆疗法的一部分。 在该研究中，“Biacore SPR 系统用于确定抗刺突 mAb 与 SARS COV2 刺突蛋白结合的结合动力学和亲和力。”

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