背景：
骨关节炎(OA)是一种衰老或创伤相关的退行性关节疾病，其确切发病机制仍不明确。目前尚无有效的疾病治疗方法，迫切需要开发新的治疗药物。因此，了解控制软骨细胞肥大和调控细胞外基质降解相关基因表达的机制对于开发有效的OA治疗方法具有重要意义。

内容概述：
2018年3月，辉骏生物合作伙伴，南方医科大学第三附属医院骨科器官衰竭研究国家重点实验室在期刊Ann Rheum dis上发表了题为“Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway”的文章，深入探究了酪氨酸激酶Fyn在小鼠骨关节炎(OA)发生发展中的作用及其机制。结果表明，Fyn在人OA软骨、老年小鼠软骨和创伤后OA软骨中的表达均明显上调。Fyn聚集在关节软骨细胞中，与β-catenin的第142位酪氨酸（Tyr142）直接作用并使其磷酸化，稳定β-catenin，促进其核转位。Fyn基因的缺失有效延缓了小鼠创伤和年龄相关的OA发展。Fyn抑制剂AZD0530和PP1通过阻断β-catenin途径和降低关节软骨中细胞外基质分解代谢酶的水平而延缓OA的进展。靶向Fyn或成为治疗OA的一种新方法。

主要技术：
iTRAQ、CoIP MS、western blot，qPCR，基因过表达/干扰等；
辉骏生物为本研究提供了iTRAQ蛋白质组学检测和分析服务。

研究路线：

 
研究结果：
1. Fyn在老年小鼠、创伤后OA小鼠和人类OA患者的关节软骨中积累
研究者首先采用iTRAQ蛋白质组学技术研究了年轻(2个月)和老年(12个月)小鼠关节软骨中的差异蛋白质，发现酪氨酸激酶Fyn在老年软骨强烈上调 (图1A)。通过Western blotting和免疫荧光实验也证实了这一结果 (图1B，C)，确定了Fyn的积累伴随着老年小鼠软骨的退化和OARSI分级的增加(图1C，D)。之后又检测了Fyn在手术诱导的创伤后骨关节炎小鼠模型中的表达，发现骨关节炎小鼠中Fyn水平随着软骨损伤的增加而显著增加。在老年OA患者关节软骨中，Fyn水平明显较高，同时软骨结构发生变性和丢失(图1E，F)。这些结果表明，Src激酶家族成员Fyn在老年小鼠的退化关节软骨和OA患者的损伤关节软骨中高水平表达。
 

2. Fyn基因缺失阻止小鼠创伤后和衰老相关OA的发生    
为了确定Fyn在退化或受损软骨细胞中积累的生物学意义，研究者进行了小鼠Fyn基因敲除实验(图2A，B)。与对照组相比，基因敲除组（Fyn-KO）小鼠关节软骨或生长板的形态和组织均没有明显差异，这表明Fyn基因的缺失没有引起小鼠骨骼发育异常。与对照组相比，Fyn-KO组小鼠的软骨中蛋白质含量显著减少，TUNEL染色显示Fyn-KO小鼠关节软骨细胞凋亡明显减少(图2G)，软骨降解程度有所降低。这些结果表明，Fyn的缺失有效地阻止了小鼠创伤后OA和年龄依赖性OA的发展。

 

3. Fyn结合软骨细胞中的β-catenin、磷酸化Tyr142并使其稳定
为了探讨Fyn促进OA发展的机制，研究者采用CoIP-MS方法筛选软骨前体细胞系ATDC5中的Fyn结合蛋白，发现β-catenin可能是Fyn的潜在互作蛋白(图3A)。CoIP实验证实了两者在ATDC5细胞(图3B)、原代软骨细胞和软骨组织中存在相互作用。免疫荧光结果也显示β-catenin与Fyn在ATDC5细胞中共定位(图3C)。对软骨细胞的体外Fyn激酶检测发现Fyn可使β-catenin发生Tyr142磷酸化，且该作用可被Fyn激酶抑制剂PP1或AZD0530所抑制（图3D）。此外，当Fyn被siRNA干扰后，β-catenin及其Tyr142磷酸化显著下调，当Fyn过表达时则相反 (图3E,F)。为了验证Fyn在β-catenin信号通路中的作用，作者在ATDC5细胞中检测了E-cadherin-catenin复合体的形成，发现Fyn被抑制时可以稳定钙粘连蛋白-连环蛋白复合体，而Fyn过表达则破坏了该复合体(图3H)。这些数据表明，Fyn结合β-catenin、磷酸化Tyr142并使其稳定，导致软骨细胞中E-cadherin-catenin复合体解离。

 
4. Fyn激活β-catenin通路促进OA的发生
Fyn和β-catenin的免疫荧光结果显示，随着Fyn水平的增加，β-catenin从细胞膜转移到了细胞核(图4A)。用白介素1β(IL-1β)处理ATDC5细胞，发现其剂量依赖性地诱导Fyn和β-catenin在细胞浆和细胞核中积聚(图4B)，并上调Fyn蛋白及其磷酸化水平(Tyr416)、β-catenin蛋白及其磷酸化水平(Tyr142)，以及MMP13蛋白水平(图4C)。接下来，研究者评估了老年小鼠和创伤后OA小鼠软骨中β-catenin蛋白及其磷酸化水平。结果显示，β-catenin及其磷酸化水平随着年龄的增长和OA的加重而增加(图4D)。此外，创伤后Fyn敲除小鼠关节软骨细胞中的β-catenin水平及其核定位明显低于对照组(图4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途径的激活剂。Fyn敲除实验显示，在OA发展过程中，Fyn激活了不依赖Wnt信号的β-catenin通路，并增强了β-catenin在关节软骨细胞中的核转位。

作者接着研究了Fyn是否通过β-catenin通路促进骨关节炎的发展。关节注射ICG-001（一种β-catenin/TCF 介导的转录抑制剂）明显减少了软骨损伤，维持了关节软骨中蛋白多糖的含量，并降低了OA发生过程中的关节炎分级，退化软骨中MMP13和ADAMTS5的表达水平也相应降低。这些结果表明，β-catenin通路参与了Fyn刺激软骨细胞MMP13和ADAMTS5的表达以及小鼠OA的发生与发展。
 

5. Fyn抑制剂AZD0530和PP1抑制β-catenin信号转导并阻止小鼠骨性关节炎的发生
为了研究Fyn作为OA治疗靶点的潜在用途，研究者采用Fyn化学抑制剂AZD0530和PP1处理小鼠并收集其关节，与对照小鼠相比，AZD0530和PP1处理显著减少了软骨破坏(图5A)、OARSI分级(图5B)和滑膜炎症，MMP13、ADAMTS5和X胶原含量、TUNEL阳性软骨细胞数和骨钙素表达也显著减少(图5C，D)。这些结果表明，抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠创伤后OA的发生。Western blotting显示AZD0530或PP1可阻断IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上调，并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加（图5E）。接下来，研究者检测了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治疗的创伤后OA小鼠的软骨样本中p-β-catenin(Tyr142)的表达。结果显示，AZD0530和PP1处理的小鼠，MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表达均明显降低(图5F)。此外，用AZD0530或PP1治疗OA时，Fyn和β-catenin在软骨细胞核中也不再结合 (图5G)。这些结果表明，AZD0530和PP1通过抑制FYN诱导的磷酸化β-catenin的表达来预防OA的发生。

 
结论：
本研究首次证明了SFK家族成员Fyn在软骨退化和骨关节炎发展中有重要作用：（1）发现Fyn在衰老小鼠、患有实验性骨关节炎的小鼠和骨关节炎患者的关节软骨中积累。（2）发现Fyn结合β-catenin，磷酸化Tyr142和并增强其核转位，这一作用在调节基质降解酶的表达和骨关节炎的发展中起着重要作用。