内容概述：

2022年3月，辉骏生物的合作伙伴——中山大学中山眼科中心团队在期刊Advanced Science（IF₂₀₂₀=16.806）上发表题为“MYPT1/PP1-Mediated EZH2 Dephosphorylation at S21 Promotes Epithelial-Mesenchymal Transition in Fibrosis through Control of Multiple Families of Genes “的文章。实验发现甲基转移酶EZH2在晶状体中高表达，AKT-EZH22通路在TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）中非常重要。质谱分析结果显示，MYPT1/PP1能使EZH2-S21去磷酸化。这些结果确定了EZH2-S21的特异性磷酸酶，并揭示了EZH22去磷酸化控制的、与晶状体EMT和眼睛前囊下白内障（ASC）发病相关的几个基因家族。

主要技术：

shRNA慢病毒稳转株构建、免疫共沉淀（Co-IP）、蛋白质谱检测（LC-MS/MS）、CRISPR/Cas9；

辉骏生物为本研究提供了蛋白质谱检测和分析服务（LC-MS/MS）。

研究背景：

EZH2是多梳抑制复合物2(PRC2)中发挥甲基转移酶活性的核心成员，可以催化H3K27Me3，进而抑制下游基因转录。此外，EZH2还可以作为独立于PRC2复合物的非组蛋白甲基转移酶，甲基化转录因子和其他靶标。蛋白磷酸化在EZH2功能开关中起着重要作用。已知AKT激酶可以介导EZH2-S21磷酸化来抑制其H3K27Me3催化功能。然而，负责EZH2-S21去磷酸化的酶仍然未知。

研究路线：

研究结果：

1. EZH2在晶状体上皮细胞中高表达且其活性和S21磷酸化水平随EMT而增强

为了解EZH2在晶状体中的作用，Western blot（WB）检测了3周龄和成年小鼠晶状体上皮细胞和纤维细胞中的EZH2和EZH2-S21磷酸化（p-EZH2 S21）水平，结果显示：EZH2在3周龄和成年上皮细胞中均高表达，p-EZH2 S21在成年上皮细胞中的水平显著高于3周龄小鼠，EZH2和p-EZH2 S21在成年纤维细胞中几乎检测不到（图1A，B）。

正因为EZH2在小鼠晶状体中高表达，因此推测其可能参与ASC上皮细胞的EMT进程。对患者和小鼠模型的ASC斑块进行IF和WB分析，发现AKT活性和p-EZH2 S21水平显著高于对照（图1C-E）。低活性的EZH2（表现为较高的p-EZH2-S21和较低的H3K27me3）伴随着为高水平的EMT标记物（FN和α-SMA）（图1E）。

图1

2. TGF-β激活AKT-EZH2-H3K27Me3通路来介导晶状体上皮细胞中的EMT

为了确定AKT是否也能磷酸化EZH2-S21来调节晶状体细胞的EMT，作者首先用TGF-β处理人晶状体上皮细胞系HLE 48小时，建立了EMT模型，接着用AKT活性抑制剂来封闭AKT的活性，这使得p-EZH2 S21减弱，H3K27Me3增强，并且消除了TGF-β诱导引起的EMT标记物FN1和α-SMA的水平增加；AKT1和AKT2的敲低也得到了类似结果（图2A-G）。这表明AKT能调控EZH2-S21磷酸化，介导TGF-β诱导的晶状体上皮细胞EMT。

图2

3. MYPT1-PP1使EZH2-S21去磷酸化

那么是哪个蛋白酶去磷酸化EZH2-S21呢？作者利用OA（PP1和PP2A的有效抑制剂）处理HLE细胞，发现OA剂量依赖性的增加了p-EZH2 S21水平（图3A-B）。免疫共沉淀质谱（Co-IP MS）分析发现EZH2的结合蛋白除了有PRC2的其他组分SUZ12、EED和RBBP4之外，还有PP1调节亚基PPP1R12A（也称为MYPT1），这引起了作者的注意。Co-IP WB和IF实验进一步确定了EZH2和MYPT1间的相互作用（图3C-F）。

图3

4. MYPT1敲除增强了晶状体上皮细胞EMT

为了证实MYPT1-PP1通过去磷酸化EZH2影响晶状体上皮细胞的EMT进程，作者采用CRISPR/Cas9技术敲除HLE细胞中的MYPT2，发现p-EZH2 S21增强，H3K27Me3水平下降（图4A-C），并且TGF-β诱导的EMT显著增强（图4D-G）。MYPT2和EZH2沉默的斑马鱼突变体也表现出严重的心脏水肿、脊柱弯曲和小眼等表型，眼部组织中的EMT标志物（FN1a, LAMC2和MMP9）也显著上调。这些结果表明，MYPT1-PP1可以使EZH2去磷酸化，激活其甲基转移酶活性，并在体外和体内调节EMT。

图4

5. 内源性EZH2-S21突变抑制了TGF-β诱导的EMT

为了进一步确定EZH2-S21磷酸化能否从功能上控制EMT进程，作者采用EZH2野生型和EZH2-S21突变型（丝氨酸突变成赖氨酸）慢病毒分别感染HLE细胞构建稳转细胞株（图5A-C），WB和IF分析证实，相比于空载对照，它们的表达均显著抑制了TGF-β诱导的EMT标志物上调（图5D-G）。

图5

6. EZH2去磷酸化调控多个EMT相关的基因家族

为了找到EZH2去磷酸化调控的下游基因，作者对EZH2野生型、EZH2-S21突变型和空载对照细胞株进行了转录组分析, GO分析结果显示很多差异基因属于细胞外基质基因和细胞粘附基因；之后又在敲除了内源EZH2的细胞中再表达EZH2野生和EZH2-S21突变体，并用TGF-β处理。qPCR检测了转录组筛选出的差异基因，确定了三个参与EMT调控的基因家族——胶原基因、细胞外基质基因和细胞粘附基因（图6A-D）。为了进一步证实EZH2去磷酸化调控了这3个基因家族，选取了3个主要靶基因Col1A1、MMP17和POSTN进行ChIP-seq，发现TGF-β处理的HLE细胞中的H3K27me3水平远小于未处理组（图6E）。

图6

7. EZH2-S21磷酸化调控POSTN基因来促进TGF-β诱导的EMT和ASC

为了进一步确定上述EMT相关基因家族确实受EZH2-S21去磷酸化控制并参与EMT和AGS病变，研究者利用慢病毒构建EZH2沉默的HLE细胞系，再此基础上分别进行EZH2过表达、EZH2-S21A过表达和EZS2-S21D过表达（图7A-C）。qPCR检测发现POSTN在EZS2-S21D细胞中的丰度最高（图7D）。使用CRISPR/Cas9技术（图7E）或shRNA（图7F）敲除MYPT1可显著增加POSTN mRNA水平，在MYPT1突变的斑马鱼眼睛中也观察到POSTN的表达增强。

在POSTN沉默细胞中，TGF-β处理组的EMT标记物（FN、COL1A1、SNAI1和SNAI2）水平均显著低于非沉默细胞（图7G-J）。在POSTN基因敲除小鼠中，ASC的诱导受到限制，EMT标志物（FN、COL1A1）的表达也显著降低（图7K-M）。在患者ASC斑块中，POSTN也高表达（图7N）。

图7

8. MYPT敲除促进了EMT相关基因表达和AGS病变

为了进一步确定EZH2-S21去磷酸化直接控制的EMT相关基因，研究者用TGF-β处理MYPT敲除细胞或未敲除细胞，qPCR方法检测发现SPARC、BGN、PCDHB8、PCDHB16、COL1A1、COL4A1、COL4B2和COL7A1的水平显著高于对照（图8A）。在ASC小鼠模型（图8B）和人类ASC患者（图8C）中也得到了相似结果，表明这些由EZH2-S21去磷酸化控制的EMT相关基因显著促进了ASC病变。

图8

研究结论：

该研究不仅确定了AKT激活EZH2-H3K27Me3来调控TGF-β诱导的晶状体上皮细胞EMT，而且发现了MYPT1-PP1可使EZH2-S21去磷酸化，进而调控3个EMT相关基因家族参与ASC病变（图8D）。