背景：
结直肠癌(CRC)是全球癌症相关性死亡的主要原因之一，复发率和转移率较高。阐明CRC发生和转移的机制将有助于寻找新的诊断生物标志物和开发有效的治疗干预措施。在过去的研究中已经发现了一些参与结直肠癌形成和发展的蛋白质编码基因，本研究主要针对microRNA（miRNA）在CRC中的作用进行探讨。

内容概述：
2019年2月，南方医科大学南方医院消化内科重点实验室在期刊Nature Communications上发表题为“The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer”的文章，发现CRC组织中miR-500a-5p的低表达与CRC恶性发展相关。在CRC细胞中过表达miR-500a-5p可使其G0/G1期阻滞，抑制其生长和迁移。从机制上讲，miR-500a-5p直接结合HDAC2基因并抑制其介导的裸鼠大肠癌细胞增殖。转录因子YY1与miR-500a-5p的启动子结合并负调控其转录，且miR-500a-5p的水平还受到p300/YY1/HDAC2复合体的协同调控。小鼠模型实验也表明miR-500a-5p表达可显著抑制肿瘤的发展。该研究为结直肠癌治疗提供了新的潜在候选基因。

主要技术：
Co-IP、ChIP、蛋白质谱检测（LC-MS/MS）、双荧光素酶分析等；
辉骏生物为本研究提供了蛋白质谱检测和分析服务。

研究路线：

 
研究结果：
1. miR-500a-5p在CRC中低表达，与 CRC的恶性发展有关
研究者通过miRNA微阵列分析确定了人正常结肠上皮FHC细胞和人结肠癌细胞系SW620和LoVo中的miRNA表达谱，其中17个miRNA在2种CRC细胞中有相似的表达模式（图1a），并从中选择了miR-500a-5p做进一步研究。qPCR检测确认miR-500a-5p在CRC细胞系及人类CRC组织中低表达（图1b-d）。原位杂交（ISH）显示miR-500a-5p定位于细胞核和细胞质中（图1e）。此外，研究者将患者按照低表达/高表达分组，Kaplan–Meier生存曲线分析结果显示，miR-500a-5p表达低的结肠癌患者的总体生存期较短。这些发现表明，miR-500a5p在CRC细胞中的低表达与CRC患者的低生存率有关。

CRC的临床病理特征分析结果表明miR-500a-5p的低表达与CRC的恶性进展有关。为探讨miR-500a-5p的作用，分别在低表达miR-500a-5p的CRC细胞中转染miR-500a-5p模拟物，在正常人结肠上皮细胞中转染miR-500a-5p抑制剂。克隆形成实验和EDU实验结果表明，miR-500a-5p水平升高导致细胞增殖受到抑制，水平降低导致细胞增殖加快（图1f-i）。FACS分析、伤口愈合、transwell迁移和侵袭实验也进一步表明，miR-500a-5p对CRC细胞的恶性特征有抑制作用。

2. HDAC2是miR-500a-5p的靶标
采用4个公共的miRNA预测工具(miRanda, TargetScan, miRTP 和RNA22-HSA)，并结合表达谱数据(图2a)，预测miR-500a-5p的靶基因，发现HDAC2可能是其潜在靶标 (图2b)。首先，WB和qPCR检测潜在靶基因HDAC2与miR-500a-5p水平是否有相关性，结果显示10对癌组织和正常组织样本中的HDAC2蛋白水平较高，而miR-500a-5p水平较低(图2c，d)；81例CRC患者组织中HDAC2的mRNA水平与miR-500a-5p水平呈负相关(图2e)。之后，采用荧光素酶报告基因实验来确定HDAC2是否为miR-500a-5p的直接靶标，结果显示，miR-500a-5p模拟物与HDAC2-3ʹ UTR共转染细胞后，荧光素酶活性降低，而当突变了3’UTR上的2个潜在结合位点中的任意一个后，miR-500a-5p都不能再抑制荧光素酶活性(图3a，b)，进一步证实了HDAC2是miR-500a-5p的靶基因。当在CRC细胞中转染miR-500a-5p 模拟物后，HDAC2蛋白表达下调，在正常人结肠上皮细胞中转染miR-500a-5p抑制剂后，HDAC2蛋白表达上调(图3c)。克隆形成、WST-1和Transwell实验表明，HDAC2的过表达可以部分消除miR-500a-5p对细胞恶性特征的抑制作用(图3d-f)。综上所述，miR-500a-5p通过抑制HDAC2的表达来阻碍CRC发生和发展。
 

3. miR-500a-5p通过靶向HDAC2在体内抑制CRC细胞的生长
接下来，研究者分别将表达miR-500a-5p、m-NC、HDAC2、空载体，和同时表达miR-500a-5p/HDAC2的LoVo细胞移植到小鼠体内，建立了5种小鼠异种移植模型，评估miR-500a-5p对体内肿瘤生长的影响 (图4a)。结果发现，miR-500a-5p组的肿瘤最小，HDAC2组的肿瘤最大，miR-500a-5p/HDAC2组的肿瘤小于HDAC2组 (图4a，b)；之后他们又检测了五组移植瘤中细胞增殖(Ki-67)和血管生成(CD105)标志物蛋白的表达。IHC染色结果显示，miR-500a-5p组的增殖率和肿瘤血管密度最低，HDAC2组最高， miR-500a-5p和HDAC2的过表达部分削弱了HDAC2对生长速度和肿瘤血管密度的作用(图4c- f)。这些数据证实miR-500a-5p抑制了HDAC2介导的小鼠CRC细胞的生长。
 

4. miR-500a-5p受转录因子YY1负调控
为了确定miR-500a-5p受哪些因素调控，研究者分析了其基因上游1kb的基因组DNA序列。双荧光素酶报告基因结果表明，该序列中含有miR-500a-5p启动子。以往报道证实转录因子YY1与HDAC相互作用，因此作者研究了转录因子YY1能否调控CRC细胞中miR-500a-5p的表达。CONSITE软件分析显示YY1在miR-500a-5p启动子上有3个潜在结合位点（−327~−333，−622~−628和−741~−747） (图5a，b)。接着，将这三个位点序列分别构建荧光素酶载体，使之与YY1载体或空载体共转染细胞进行双荧光素酶检测，结果表明，YY1的加入使这3个位点序列的启动子活性均降低了2.5倍以上(图5c)。为了证实YY1能够在体内与miR-500a-5p启动子结合，作者在过表达YY1的CRC细胞中用YY1抗体进行了ChIP-qPCR检测，确定miR-500a-5p启动子区域的这3个潜在结合位点均有显著富集(图5d)。

接下来，他们分析了YY1和miR-500a-5p在CRC组织中的表达关系，发现癌组织中有更高水平的YY1（蛋白和RNA）和更低水平的miR-500a-5p (图5e，f)。此外，CRC细胞中YY1的瞬时表达导致miR-500a-5p成熟体、前体和初始转录本的转录都减少了(图5g)。研究者还评估了HDAC2或YY1的表达与临床病理参数之间的关系。结果表明，HDAC2和YY1的表达与CRC分化程度、淋巴结转移和TNM分期显著相关。最后，采用免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)方法检测基因表达。结果显示，miR-500a-5p在CRC组织中的表达明显低于癌旁组织，HDAC2和YY1的表达明显高于癌旁组织。miR-500a-5p的表达与HDAC2或YY1呈负相关（图5h）。这些结果表明，YY1下调了CRC细胞miR-500a-5p的水平，进而影响HDAC2水平。  
 

5. YY1/p300/HDAC2复合体调控了CRC细胞中miR-500a-5p的水平
由于组蛋白乙酰化水平受到组蛋白乙酰转移酶(CBP/p300, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的共同调控。以往报道指出，HDAC2和p300均可与YY1相互作用，因此研究者进一步探讨了HDAC2-p300，HDAC2-p300-YY1的作用关系。过表达和内源性P300蛋白的Co-IP实验均显示P300可以与HDAC2和YY1相互作用(图6a，c)，过表达和内源性HDAC2蛋白的Co-IP实验也证实了这一结果(图6b，d)，表明HDAC2-p300-YY1可能以复合物形式存在。

为了探讨miR-500a-5p与YY1/p300/HDAC2复合体的关系，设置如下组别：YY1、HDAC2、p300、YY1+p300、HDAC2+p300、YY1+HDAC2+p300；转染细胞后检测miR-500a-5p水平，发现p300可促进miR-500a-5p转录，YY1或HDAC2抑制其转录，p300与HDAC2和/或YY1的组合也抑制其转录(图6e)，表明YY1或HDAC2对p300有拮抗作用。之后以上7组载体分别与miR-500a-5p启动子的荧光素酶载体共转染细胞，检测miR-500a-5p启动的双荧光素酶活性，进一步确定了p30的促进作用，及其YY1或HDAC2的抑制作用(图6f)。ChIP实验证实YY1和miR-500a-5p启动子三个位点的结合程度受YY1自身水平，以及HDAC2和p300水平影响。YY1、HDAC2的过表达增加了YY1与miR-500a-5p启动子3个位点的结合，而p300的过表达减少了YY1与这3个位点的结合(图6g)；当干扰YY1、HDAC2和p300时，结果刚好相反(图6h)。此外，p300的过表达则削弱了HDAC2与3个YY1结合位点的结合。这些结果表明，YY1/p300/HDAC2复合体调控了CRC细胞中miR-500a-5p的水平。
 

6. miR-500a-5p能够抑制异种移植瘤和FK228治疗的CRC肿瘤发展
为了研究miR-500a-5p在结直肠癌中的作用分子机制，研究者检测了miR-500a-5p对细胞凋亡的影响，确定miR-500a-5P能诱导LoVo细胞凋亡。当miR-500a-5p与HDAC抑制剂FK228共同作用时，细胞凋亡率要显著高于单独转染miR-500a-5p的组别(图7a)。这些结果表明miR-500a-5p可促进肿瘤细胞凋亡，并增强肿瘤细胞对FK228诱导的凋亡的敏感性。为了探讨miR-500a-5p对CRC的治疗潜力，研究者建立了异种移植小鼠模型和FK228处理的CRC模型。结果显示，移植LoVo细胞39天后，miR-500a-5p和miR-500a-5p+FK228组小鼠的肿瘤体积明显小于m-NC组（图7c，d）。TUNEL染色显示，miR-500a -5P+FK228组的肿瘤细胞凋亡率最高(图7e)。这些发现提示miR-500a-5p增强了癌细胞对HDAC抑制剂FK228诱导的凋亡的敏感性。以上结果表明，miR-500a-5p具有肿瘤抑制作用，具有治疗CRC的潜力。

结论：
本研究确定miR-500a-5p在结直肠癌组织中下调，miR-500a-5p水平受到YY1/p300/HDAC2转录复合体的协同调控。此外，miR-500a-5p还通过直接结合HDAC2的3’UTR来抑制结直肠癌细胞增殖和迁移。