中文标题：FEN1促进非小细胞肺癌肿瘤进展并增强顺铂耐药性

发表期刊：Molecular Oncology

影响因子：5.314

发表时间：2017年2月

合作单位：南京师范大学生命科学学院

运用技术：慢病毒包装（由辉骏生物提供技术支持）

● 研究背景

肺癌是全球男性和女性癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌病例的85%。如今在临床治疗中，大多数抗癌剂通过干扰DNA复制或诱导DNA损伤的方式来杀死细胞，进而导致细胞凋亡。在这些抗癌药物中，顺铂代表了癌症临床治疗史上一个成功的里程碑。然而，由于癌细胞中高效的DNA复制和修复系统，顺铂的疗效并不充分，耐药机制也有待于进一步研究。

以往的报道表明，癌症对DNA损伤诱导剂的耐药性与癌细胞中DNA修复酶的表达升高有关。DNA翻盖内切酶1(FEN1)是DNA修复途径中的关键分子，鉴于顺铂诱导的DNA加合物链内交联主要由NER修复，我们推测抑制FEN1表达或抑制FEN1活性可能增强顺铂的治疗效果。鉴于FEN1在DNA复制中的作用，推测FEN1可能是肺癌细胞增殖所必需的。FEN1参与了NER和其他DNA修复途径，说明靶向FEN1可能是克服肺癌对顺铂耐药性的潜在途径。FEN1抑制剂或可单独作为阻断癌细胞增殖的药物，或者与DNA损伤诱导剂联合使用，以提高治疗效果。

● 研究结果

1.     FEN1在肺癌细胞中上调并与预后不良相关

作为DNA复制的重要参与者，FEN1可能在癌症组织中上调表达。研究者通过数据库比较了癌组织和正常组织中FEN1的表达水平，结果表明，肺癌组织中FEN1 mRNA的表达水平显著高于正常组织(图1A)。研究者进一步通过免疫组织化学(IHC)分析比较了正常组织和肺癌样本中FEN1蛋白的表达水平，证实了这一观察结果(图1B)。在正常组织中，FEN1评分低于100分的患者占85%，这一比例明显低于癌组织。相反，癌组织中FEN1评分在200分以上的患者比例明显高于正常组织。数据库数据分析结果表明，肺癌的恶性程度随着FEN1表达水平的增加而升高(图1D)，这说明肺癌的恶性程度与FEN1的过度表达有关。相应地，FEN1水平高的患者总体生存时间明显短于FEN1水平低的患者(图1E)。这些结果提示FEN1在肺癌中表达上调，与肿瘤恶性程度和预后不良有关。

图1

2. FEN1促进肿瘤的体内外进展

本研究选择A549细胞作为非小细胞肺癌药物代谢研究的体外模型。上述数据已经表明FEN1的过度表达与癌症有关，但FEN1的高表达是否会影响肿瘤进展尚不清楚。研究者比较了FEN1被siRNA下调的A549细胞的增殖率(图2A)和FEN1异位过表达的A549细胞的增殖率(图2B)。结果表明，FEN1的下调抑制了细胞生长(图2C)，而FEN1的过表达促进了细胞生长(图2D)。集落形成实验表明，过表达FEN1诱导了A549细胞的集落形成(图2E-F)，而内源性FEN1的下调则降低了A549细胞的集落形成效率(图2G)。此外，流式细胞分析显示，与对照细胞相比，FEN1基因敲除导致S期和G2/M期比例降低，G1期比例增加。将异位FEN1过表达的细胞移植到裸鼠皮下后，其肿瘤体积明显大于亲本A549细胞(图2H)。这些结果表明，FEN1促进了肿瘤在体内和体外的进展。

图2

3. FEN1在A549细胞顺铂耐药中的作用

鉴于FEN1在多个修复过程中的作用，例如BER、非同源末端连接、HR、NER和错配修复等，推测FEN1在肿瘤中的高水平表达与固有或获得性耐药有关。为了验证这一假设，研究者在不同FEN1水平的A549肺癌细胞中进行了药物敏感性实验。结果表明，FEN1的过表达对顺铂具有保护作用(图3A)，同时，FEN1基因敲除使A549细胞对顺铂敏感(图3B)。为了进一步分析FEN1对细胞凋亡的影响，研究者测定了顺铂处理后的亚G1期细胞比例。结果表明，在顺铂作用下，FEN1基因的敲除导致亚G1期细胞积聚(图3C)。FEN1的过表达减少了顺铂诱导的亚G1期片段的产生(图3D)。TUNEL染色显示，FEN1基因敲除细胞在顺铂处理后比对照细胞凋亡更多(图3E，F)，而FEN1过表达细胞凋亡比对照细胞更少(图3G，H)。这些数据表明FEN1对顺铂诱导的细胞凋亡具有保护作用。

研究者开发耐药细胞，并设计实验来评估克服顺铂耐药性的可能性。研究者将从A549肺癌细胞中建立的顺铂耐药细胞命名为A549-顺铂-R细胞或简称为A549-R。使用10和20微升的FEN1抑制剂C20处理A549-R细胞3天。结果显示，A549-R细胞对顺铂的耐药性部分丧失。

图3

4. FEN1表达对顺铂诱导的A549细胞DNA损伤修复的影响

顺铂所致损伤的修复缺陷可导致未修复的DNA中间体和DNA双链断裂(DSB)的积聚。因此，研究者预测FEN1下调的细胞将比对照细胞表现出更高水平的DNA双链断裂。为了验证假设，研究者确定了细胞中DNA双链断裂的标志物cH2AX和53BP1的病灶。的确，FEN1的下调导致了cH2AX(图4A，B)和53BP1(图4E，F)在细胞中的积累。相反，FEN1过表达降低了顺铂诱导细胞内cH2AX(图4C，D)和53BP1(图4G，H)的病灶形成水平。顺铂引起的未修复DNA损伤的积累将导致染色体断裂。为了测试FEN1对顺铂诱导的染色体断裂的影响，研究者分析了中期细胞核的染色体畸变。与对照亲本细胞相比，FEN1缺陷细胞的染色体片段和断裂水平显著增加(图4I-J)。然而，高FEN1表达水平的细胞显示染色体断裂水平降低(图4K)。

图4

5. FEN1抑制剂导致未修复的DSB积聚并增强对顺铂的敏感性

基于以上结果，研究者推测FEN1特异性抑制剂可以作为一种抗癌药物，既可以单独使用来抑制癌细胞的生长，也可以与DNA损伤诱导剂联合使用来提高治疗效果。研究者使用一种FEN1抑制剂C20验证假设，为了确定靶向抑制FEN1能否增强顺铂在A549细胞中的活性，用C20预处理A549细胞，然后用不同浓度的顺铂处理48h，图5A显示C20处理的细胞存活率显著降低。与仅用顺铂处理的细胞相比，C20和顺铂处理的细胞显示出更多的cH2AX和53BP1病灶(图5B-E)。为了评价FEN1抑制剂对不同FEN1水平细胞的毒性，研究者还比较了C20在不同肺癌细胞系中的IC50。结果显示A549、H1299和H460细胞增殖呈剂量依赖性下降，IC50分别为12.5、22.1和20.81M(图5F)。值得注意的是，FEN1表达水平低的细胞对FEN1抑制剂的敏感性较低。提示FEN1在不同癌细胞中的表达可能与其对FEN1抑制剂的敏感性有关。

图5

6. 抑制FEN1对移植瘤小鼠的抗肿瘤作用

为了进一步研究抑制FEN1对体内肿瘤进展的影响，研究者用裸鼠进行了异种移植研究。结果显示，对照组小鼠肿瘤体积以时间依赖的方式逐渐增大。单独使用顺铂或FEN1抑制剂治疗后，移植瘤的生长略有下降（图6A）。当顺铂与FEN1抑制剂联合应用时，肿瘤生长明显减少。同时，联合治疗组动物存活率也有所提高（图6B）。这些结果表明，抑制FEN1可以增强顺铂对小鼠肺癌移植瘤的疗效。

图6

7. FEN1的下调或抑制激活了细胞凋亡的内在途径

P53通路是最常见的细胞凋亡机制。在应激状态下，p53被磷酸化后激活，并作为转录因子激活凋亡相关基因的表达。研究者检测了FEN1缺乏诱导的细胞凋亡是否依赖于p53，发现顺铂(图7A)诱导P53和磷酸化的P53，表明其激活了P53通路。作为p53激活的下游事件，A549细胞中的凋亡指标caspase-3也在顺铂作用下上调。此外，c-H2AX显示DNA损伤程度与凋亡指标上调相关，顺铂可上调DNA损伤程度(图7A)。

为了明确DNA损伤是否可以诱导凋亡反应，研究者用FEN1 siRNA处理A549细胞，并检测了A549细胞的凋亡反应。结果显示，FEN1基因敲除增加了FC-H2AX的水平。同时，FEN1基因敲除后，磷酸化的p53和caspase-3的表达也被上调，这与顺铂处理结果类似(图7B)。这些数据表明，DNA损伤是由FEN1基因敲除引起的，并可能诱导p53依赖的细胞凋亡。为了进一步证实FEN1和DNA损伤水平在顺铂诱导的细胞凋亡中的作用，研究者测定了FEN1过表达的A549细胞对顺铂的反应。如图7C所示，FEN1的过表达减少了顺铂诱导的DNA损伤，顺铂诱导的p53活化和caspase-3形成也明显减少。这一结果表明，FEN1通过减少细胞内DNA损伤来保护细胞免受顺铂诱导的凋亡。

接下来，研究者对图6C中的肿瘤进行了免疫组化检测。结果如图7D所示，与caspase-3和TUNEL阳性细胞处理相比，顺铂和FEN1抑制剂联合使用对细胞凋亡显示出更大的协同作用。此外，c-H2AX和53BP1染色表明，与FEN1抑制剂或顺铂单独治疗相比，FEN1抑制剂和顺铂联合治疗可在肿瘤中产生更多的DSB，这与先前的研究结果一致。综上所述，上述结果提示FEN1下调或抑制激活了p53介导的内在凋亡途径。

图7