RIP、RIP-seq或RNA免疫沉淀、RNA免疫沉淀测序是一种高通量实验技术，用于研究RNA和RNA结合蛋白之间的相互作用。它允许识别细胞或组织内的特定RNA结合蛋白。

为什么研究RNA修饰是有益的？

研究RNA修饰对于解开RNA生物学的复杂性，理解基因表达调控，破译疾病机制以及探索诊断和治疗应用至关重要。它提供了对RNA分子及其在细胞过程和疾病中的作用的更深层次的理解。

RNA修饰的失调已经涉及各种疾病，包括癌症、神经病症和代谢病症。了解RNA修饰为开发靶向治疗方法提供了机会。通过操纵负责添加或删除特定RNA修饰的酶，可以调节基因表达，改变RNA结构或纠正疾病状态中的异常RNA修饰。此外，调节RNA修饰可以为治疗干预提供新的途径。了解RNA修饰及其功能后果的前景可以指导RNA靶向治疗和精准医学方法的发展。

RIP/RIP-seq提供了对RNA结合靶点的关键见解，以及RNA结合蛋白在RNA生物学，基因表达调控和疾病中的机制作用。RIP-seq使研究人员能够深入了解RNA靶点和RBP在各种细胞过程中的调控作用，如RNA剪接、稳定性、运输和翻译。通过比较来自不同实验条件或细胞类型的RIP-seq数据，研究人员可以研究RBP结合模式的变化，并揭示基因表达的潜在调控机制。它有助于我们理解RNA-蛋白质相互作用，并且在揭示RBP在各种生物过程和疾病中的作用方面特别有价值。

RIP/RIP-seq是如何工作的？

RIP是一种涉及RBPs沿着其相关RNA分子的免疫沉淀的方法。该技术背后的原理是使用化学交联剂（通常为甲醛）将RBP交联到RNA，所述化学交联剂在特定时刻“冻结”RNA和RBP之间的相互作用。然后使用对目标RBP具有特异性的抗体对细胞或组织裂解物进行免疫沉淀。然后纯化免疫沉淀的RNA-蛋白质复合物，并逆转交联以释放RNA分子。最后，分析富集的RNA以鉴定结合的转录物。

RIP-seq将RIP技术与高通量测序技术相结合，允许对与RBP结合的RNA分子进行全基因组鉴定和表征。在免疫沉淀步骤之后，将纯化的RNA转化为cDNA片段文库，然后使用下一代测序平台对其进行测序。由此产生的序列数据提供了有关RBP结合的RNA序列的信息，使研究人员能够识别目标转录本。

以下是RIP/RIP-seq工作流的概述：

1. 交联：RIP-seq的第一步涉及将RBP与细胞内的RNA分子交联。这通常通过用化学交联剂如甲醛处理细胞来完成。交联有助于保持RBP-RNA相互作用，并防止它们在随后的加工步骤中解离。

2. 细胞裂解和免疫沉淀：然后裂解交联的细胞以释放细胞内容物。将对靶RBP具有特异性的抗体添加到裂解物中，并且这些抗体选择性地结合感兴趣的RBP。然后使用蛋白A/G珠等技术免疫沉淀RBP-RNA复合物，其结合抗体-RBP复合物。

3. RNA片段化：用RNase处理免疫沉淀的RNA-蛋白质复合物以消化未结合的RNA分子，留下RBP结合的RNA。然后从复合物中除去RBP，只留下与感兴趣的蛋白质相关的RNA分子。

4. RNA纯化：从剩余的蛋白质片段、污染物和交联中纯化RNA。这一步骤涉及各种酶处理和柱纯化，以获得高质量的RNA。

5. 文库制备和测序：通过添加衔接子并扩增RNA片段将纯化的RNA转化为测序文库。然后使用下一代测序（NGS）技术等平台对文库进行高通量测序。

6. 数据分析：将所得测序读数与参考基因组或转录组比对，以鉴定由RBP结合的RNA分子的区域。数据分析包括识别代表RBP结合位点的富集区域（峰），以及下游分析，以了解RBP-RNA相互作用的功能意义。

辉骏生物RIP（RNA免疫共沉淀）服务内容

1. RIP-qPCR，用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测RNA是否结合；

2. RIP-seq，用于筛选某样本中的诱饵蛋白可以结合哪些RNA。

RNA免疫沉淀（RIP）* 实验流程

图一：内源蛋白的RNA免疫共沉淀流程图

图二：标签融合蛋白的RNA免疫共沉淀流程图

RIP实验客户文章

1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018，IF=28.467. 【研究内容】：辉骏生物为作者单位之一，和作者共同开发了一种捕获鉴定新生RNA结合蛋白的全新方法（RICK）。该方法用EU标记新生RNA，通过点击反应-生物素-链霉亲和素系统结合质谱分析，分离鉴定RNA互作蛋白。其中，METTL1和CDK1是两个RICK独有的RNA结合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等实验进一步证实了它们与非PolyA RNA的结合，这种结合在细胞分化与增殖中发挥了重要作用。 使用相关技术：RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA结合蛋白免疫沉淀技术

2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9. 【研究内容】：客户利用RNA pull down、CoIP等技术，发现lincRNA-p21与HNRNPK结合，并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成复合物，作者通过RIP-qPCR进一步证实了细胞中存在该复合物。该复合物甲基化了多能性基因的启动子序列及相应组蛋白，并改变了它们的表达量，从而进一步影响体细胞重编程过程。 使用相关技术：RIP seq、RNA结合蛋白免疫共沉淀rip qpcr、质谱鉴定

3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756. 【研究内容】：淋巴结转移是宫颈癌（CCa）患者最恶性的临床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等实验发现：circVPRBP与OGT酶竞争结合RACK1蛋白，阻碍RACK1-S122位点的O-GlcNAc修饰来使其降解，从而抑制宫颈癌淋巴结转移和淋巴管生成。 使用相关技术：RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、质谱鉴定