RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类功能强大而广泛的调节因子，约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能，大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。

RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀）是在传统IP实验基础上衍生出的应用，核心用于研究体内RNA与蛋白的结合情况。其原理是基于抗体特异性识别目标蛋白，从而将与蛋白结合的RNA复合物沉淀下来。

目前，RIP技术主要有两大方向：一是明确特定蛋白与RNA之间的结合对应关系；二是结合高通量测序技术，筛选出RBP所调控靶基因。

样本裂解液与结合了抗体的磁珠或树脂（Beads）进行孵育，通过”抗原-抗体“之间的免疫作用，将“抗体-诱饵蛋白-互作RNA”一起“共沉淀”到Beads上。

洗掉未结合的RNA后，再将“诱饵蛋白-互作RNA”从Beads洗脱下来，提取洗脱液中的RNA，之后可以用qPCR检测已知RNA，也可以用二代测序检测未知RNA。

图1 RIP实验原理图

RIP实验大致流程：样本裂解→Input样品制备→样本裂解液与抗体孵育（抗原抗体结合）→proteinA/G磁珠与抗体结合→RNA免疫共沉淀（RIP）→复合物洗脱→RNA提取→qPCR或测序分析

1 细胞收集

（1）每组细胞收集1-2*10e7个，弃培养基；

（2）用预冷的PBS清洗细胞2-3次，彻底去除培养基成分；

2 细胞裂解

（1）加入0.6-1mL预冷的裂解缓冲液（辉骏货号：FI8101），在裂解液中预先加入6-10μL蛋白酶抑制剂（辉骏货号：FI8105）、3-5μL RNA酶抑制剂（辉骏货号：FI8106），现用现配；

（2）为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清；如果无超声条件，可置于冰上裂解30min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5s；

（3）4℃ 12000 rpm离心15 min，收集上清至新的无RNase的1.5 mL EP管中。

3 Input样本制备

（1）取30 μL作为蛋白 input，取30 μL作为RNA input；

（2）剩余上清平分为两份用于RIP实验（记为实验组和对照组），置于冰上备用或-80℃保存。

（2）每组加入200 µL漂洗液（辉骏货号：FI8107），颠倒混匀30次，放磁力架上静置1 min ，并弃上清；

（3）重复上步操作一次。

5 样本裂解液与抗体孵育

（1）向样本裂解液中加入诱饵蛋白抗体或Normal IgG，放混匀仪上室温孵育1-2 h（或4℃过夜孵育以提高灵敏度）；

（2）洗涤2次去除未结合抗体（使用漂洗缓冲液）。

6 protein A/G磁珠与抗体结合

（1）向protein A/G磁珠中加入的样本-抗体混合物，放混匀仪上4℃孵育2 h；

（2）放磁力架上静置 1 min 并弃上清；

（3）每组加入500 μL漂洗液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1 min，后弃上清；

（4）重复上步操作一次；

（5）再次加入500 μL漂洗液，颠倒混匀30次；

（6）取100 μL移入新离心管中用于蛋白检测（标注为管1），剩余400 μL用于RNA提取（标注为管2），两管分别放磁力架上静置1 min 并弃上清，保留磁珠。

7 蛋白Input和诱饵蛋白检测

（1）向蛋白Input组、管1的磁珠中加入1×SDS-PAGE上样缓冲液，95℃加热5-10 min；

（2）管1放磁力架上静置1 min，收集上清至新的离心管中，Western Blot检测诱饵蛋白的表达情况，验证是否IP成功。

8 RNA提取纯化

方案1——试剂盒提取RNA，可按照微量RNA提取试剂盒来提取RNA。

方案2——Trizol法提取RNA

（1）向管2的磁珠中加入1 mL Trizol，室温静置5 min；4℃ 12000 g 离心10 min，取上清；

（2）加入0.2 mL氯仿，涡旋混匀或猛烈晃动15 s，室温放置2~3 min；

（3）4℃ 12000 g离心15 min，吸取水相至新的无RNase1.5 mL EP管中（约可吸取0.5-0.55 mL）；

（4）加入0.5 mL异丙醇，颠倒数次混匀，室温下沉淀10 min或-20℃沉淀过夜；

（5）4℃ 12000 g离心 10 min，管底可见RNA沉淀，弃上清；

（6）加入1 mL 75%乙醇（DEPC水或RNase-free水配制）；

（7）4℃ 12000 g离心10 min，弃上清；5000 g快速离心1 s，小心吸尽液体；

（8）待RNA略干后（静置3 min），加入20 μL DEPC水或RNase-free水，将RNA洗脱下来，-80℃保存或直接进行反转录。

注意：①选择方案1（先洗脱再提取RNA），可能损失部分RNA；②如果RNA含量低，建议选择方案2（从磁珠上直接提取RNA），提取效率更高，但可能会增加非特异性。

9 RNA分析

提取后的RNA、RNA input可用于qPCR实验或高通量测序。

1、在实验设计中，需要有蛋白input组、RNA input组、诱饵蛋白抗体RIP组（实验组）和IgG抗体阴性对照组（对照组）。

2、全程保持无酶，使用不含RNase的仪器、吸头和试管，裂解缓冲液和漂洗液中添加RNase抑制剂，防止RNA降解。

3、提取的RNA需无明显降解（琼脂糖电泳可见清晰的28S、18S rRNA条带），且纯度达标OD260/280≈1.8-2.0），否则会影响后续检测结果的准确性。

4、RIP后的RNA一般较微量，操作时注意勿把RNA沉淀吸走。

5、切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/A280值会低于1.6。

1 诱饵蛋白检测结果

Input组：利用Anti-Bait对样本裂解液进行WB检测，验证Input中是否存在Bait，从而确定蛋白的表达情况以及抗体效果；

IgG组(阴性对照组)：排除非特异性结合的干扰，normal IgG不能富集Bait，一般不会有Bait条带，如果有条带说明Bait与beads或IgG有非特异性结合，需要重新完善下方法；

IP组(实验组)：Anti-Bait可以特异性富集Bait，所以一定会有Bait条带，没有条带说明IP实验失败，需要复核IP流程，或检查Anti-Bait是否可以用于IP实验。

2 待测基因检测结果

（1）qPCR检测（已知目标RNA）

Input组：实验起始的样本裂解液，用来校正RNA初始量差异，作为基础参照；

IgG组（对照组）：normal IgG的RIP产物，用于排除非特异结合RNA的干扰，验证结果特异性；

Anti-Bait组（实验组）：诱饵蛋白抗体的RIP产物，捕获与诱饵蛋白结合的RNA，用于目标检测。

计算公式：

①计算百分比Input 

%Input=2(-ΔCt[normalized ChIP])x100% 

②与阴性对照比较计算Fold Enrichment（倍数富集）

ΔΔCt[ChIP/阴性]=ΔCt[normalized ChIP] - ΔCt[normalized 阴性]

Fold Enrichment = 2^(-ΔΔCt[ChIP/阴性])

上图为RIP阳性结果示意图：表明诱饵蛋白可以与猎物RNA特异性结合，存在相互作用。

（2）高通量测序（RIP-seq，发现未知结合RNA）

结果判断：测序产生的原始数据（raw data）通过质量控制以及过滤，UMI解析和去重、纠错，获得高质量的测序数据（即clean data）。借助比对工具与研究物种的参考基因组进行比对，比对上的序列用于后续的生物信息学分析（包括read的分布和peak分析）。在全基因组范围对peak进行扫描，对扫描到的peak进行基因注释，GO、KEGG Pathway富集分析以及motif分析，深入解析RNA结合蛋白（RBP）的调控机制。

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