Q1：目的蛋白结合效率低或不结合怎么办？

可能原因1：蛋白序列出现移码等错误

解决办法1：测序确认，调整阅读框以获得GST.Tag融合表达蛋白；选择适宜的宿主菌，如蛋白酶缺陷型大肠杆菌，稀有密码子宿主菌Rosetta系列。

可能原因2：融合蛋白可能改变了GST 的构象，因此降低了GST 标签蛋白的结合能力。

解决办法2：检测所使用的pGEX 载体中GST的结合。准备带有所使用的pGEX的细胞超声裂解物，检测其与层析柱的结合。如果结合的很好，则可能是标签蛋白改变了GST 的构象，因此降低了GST 标签蛋白的亲和力。可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果。

可能原因3：GST 融合蛋白发生聚集沉淀

解决办法3：在裂解buffer和其他缓冲体系中加入DTT，经验告知，1-20mM的DTT 会显著增加某些GST融合蛋白的结合。

可能原因4：GST融合蛋白被过度稀释

解决办法4：重新浓缩样品，增加蛋白浓度。

可能原因5：GST 融合蛋白被机械裂解的方法变性（比如超声）

解决办法5：过度超声产热会破坏标签蛋白，建议采用超高压破碎。

可能原因6：结合缓冲条件不适宜

解决办法6：低于pH6.5或高于pH8时，融合蛋白与层析柱结合不充分导致结合效率低，请确认磁珠在用于目的蛋白纯化前经过pH6.5~8.0缓冲液充分的平衡。

可能原因7：层析柱使用次数过多，杂质干扰

解决办法7：层析柱再生或使用新的层析柱。

Q2：目的蛋白洗脱不下来或洗脱率低是什么原因导致的？

可能原因1：洗脱缓冲液的体积太少

解决办法1：增加洗脱缓冲液的体积。

可能原因2：洗脱缓冲液的pH过低

解决办法2：调节洗脱缓冲液pH值至8-9 。

可能原因3：洗脱的时间不够

解决办法3：增加洗脱缓冲液与磁珠反应的时间。

可能原因4：洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度太低

解决办法4：增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度。

可能原因5：洗脱缓冲液中谷胱甘肽失效被氧化

解决办法5：洗脱缓冲液现配现用。

可能原因6：洗脱缓冲液的离子强度过低

解决办法6：增加洗脱缓冲液中的离子强度，在洗脱缓冲液中加入0.1~0.2M的氯化钠也会改善洗脱效果。

Q3：洗脱的蛋白中为什么含有杂质？

可能原因1：在宿主细菌中蛋白被降解

解决办法1：使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT，或ompT和lon双缺陷型菌株。

可能原因2：GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

解决办法2：加入蛋白酶抑制剂PMSF。注：丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

可能原因3：细胞破碎时超声处理过度

解决办法3：降低裂解时间，机械裂解前加入溶菌酶（0.1 倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液，溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 ）可能会使结果变好。避免发泡，因为这可能使标签蛋白变性。过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST 标签蛋白共纯化。

可能原因4：分子伴侣或许被共纯化了

解决办法4：多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成。这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠。如：DnaK（分子量70 000）、DnaJ（分子量37 000）、GrpE（分子量40 000）GroEL （分子量57 000）、GroES（分子量10 000 ）。一些从这些共纯化的蛋白中分离GST融合蛋白的方法已经发表。

Q4：如何解决目的蛋白酶切后电泳检测发现多条条带？

可能原因：蛋白酶切发生在宿主细菌内

解决办法：检测条带何时出现：如果确定多余的条带在Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa切割前不存在，这些条带可能是在宿主细菌中被降解的结果。目的蛋白可能含有Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa 的切割位点，请检查序列。

辉骏生物提供的GST Pull down实验技术服务分为以下两种：

1. GST Pull down WB，用于体外检测诱饵蛋白与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用；

2. GST Pull down MS，用于体外筛选诱饵蛋白与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。

GST pull down技术服务优势*辉骏生物

GST融合蛋白纯化实验结果示例

GST pull down WB：Western blot检测图（阳性）

GST Pull-down MS：Western blot检测图

GST pulldown MS：质谱检索表格（部分展示）

GST融合蛋白纯化实验服务-辉骏生物客户文章

1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research.  2019，IF=9.727. 【研究内容】：前期研究表明，GYS2基因在HCC患者低表达，干扰GYS2基因表达导致肿瘤增殖转移。本研究通过融合表达GST-GYS2、His-p53、His-MDM2，并用GST-pull down方法，证实了MDM2与p53竞争性结合GYS2基因。相关的COIP、ChIP-qPCR等实验进一步阐明GYS2基因降低肿瘤增殖转移的机制。 使用相关技术: gst pulldown测定、GST-pull down质谱分析、GST标签蛋白

2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015，IF=14.467. 【研究内容】：Wnt/β-catenin信号在内皮细胞的血管生成活性中起重要作用。过表达实验表明，转录因子Bach1过表达可抑制后肢缺血小鼠的血管生成，并抑制Wnt3a刺激的血管生成反应和人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin靶基因的表达。Co-IP实验和gst pull-down分析表明，Bach1直接与TCF4结合，并减少β-catenin与TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血损伤后的血管生成的作用机制，为血管生成治疗或其他涉及Wnt/β-catenin通路异常调节的疾病提供了新的治疗靶点。 使用相关技术: GST 融合蛋白、GST pull-down实验、GST pull-down技术