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互作实验蛋白实验分子细胞实验
GST融合蛋白纯化实验问题及解决方法

Q1:目的蛋白结合效率低或不结合怎么办?

可能原因1:蛋白序列出现移码等错误

解决办法1:测序确认,调整阅读框以获得GST.Tag融合表达蛋白;选择适宜的宿主菌,如蛋白酶缺陷型大肠杆菌,稀有密码子宿主菌Rosetta系列。


可能原因2:融合蛋白可能改变了GST 的构象,因此降低了GST 标签蛋白的结合能力。

解决办法2:检测所使用的pGEX 载体中GST的结合。准备带有所使用的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与层析柱的结合。如果结合的很好,则可能是标签蛋白改变了GST 的构象,因此降低了GST 标签蛋白的亲和力。可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果。


可能原因3:GST 融合蛋白发生聚集沉淀

解决办法3:在裂解buffer和其他缓冲体系中加入DTT,经验告知,1-20mM的DTT 会显著增加某些GST融合蛋白的结合。


可能原因4:GST融合蛋白被过度稀释

解决办法4:重新浓缩样品,增加蛋白浓度。


可能原因5:GST 融合蛋白被机械裂解的方法变性(比如超声)

解决办法5:过度超声产热会破坏标签蛋白,建议采用超高压破碎。


可能原因6:结合缓冲条件不适宜

解决办法6:低于pH6.5或高于pH8时,融合蛋白与层析柱结合不充分导致结合效率低,请确认磁珠在用于目的蛋白纯化前经过pH6.5~8.0缓冲液充分的平衡。


可能原因7:层析柱使用次数过多,杂质干扰

解决办法7:层析柱再生或使用新的层析柱。


Q2:目的蛋白洗脱不下来或洗脱率低是什么原因导致的?

可能原因1:洗脱缓冲液的体积太少

解决办法1:增加洗脱缓冲液的体积。


可能原因2:洗脱缓冲液的pH过低

解决办法2:调节洗脱缓冲液pH值至8-9 。


可能原因3:洗脱的时间不够

解决办法3:增加洗脱缓冲液与磁珠反应的时间。


可能原因4:洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度太低

解决办法4:增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度。


可能原因5:洗脱缓冲液中谷胱甘肽失效被氧化

解决办法5:洗脱缓冲液现配现用。

可能原因6:洗脱缓冲液的离子强度过低

解决办法6:增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.1~0.2M的氯化钠也会改善洗脱效果。


Q3:洗脱的蛋白中为什么含有杂质?

可能原因1:在宿主细菌中蛋白被降解

解决办法1:使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT,或ompT和lon双缺陷型菌株。

可能原因2:GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

解决办法2:加入蛋白酶抑制剂PMSF。注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。


可能原因3:细胞破碎时超声处理过度

解决办法3:降低裂解时间,机械裂解前加入溶菌酶(0.1 倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好。避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性。过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST 标签蛋白共纯化。


可能原因4:分子伴侣或许被共纯化了

解决办法4:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成。这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠。如:DnaK(分子量70 000)、DnaJ(分子量37 000)、GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)、GroES(分子量10 000 )。一些从这些共纯化的蛋白中分离GST融合蛋白的方法已经发表。


Q4:如何解决目的蛋白酶切后电泳检测发现多条条带?

可能原因:蛋白酶切发生在宿主细菌内

解决办法:检测条带何时出现:如果确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在,这些条带可能是在宿主细菌中被降解的结果。目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,请检查序列。




辉骏生物提供的GST Pull down实验技术服务分为以下两种:

1. GST Pull down WB,用于体外检测诱饵蛋白与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用;

2. GST Pull down MS,用于体外筛选诱饵蛋白与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。


GST pull down检测服务

服务项目服务内容结果交付实验周期  
客户提供价格
GST pull down WB构建诱饵蛋白的GST原核表达载体(可选做)载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告约2周        

1、含有诱饵基因序列的质粒模板及测序文件

2、实验样本

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、诱饵蛋白和待测蛋白序列)

点击询价



原核表达诱饵蛋白并进行Western blot检测Western blot检测图4-5周
Western blot检测待测样本中的猎物蛋白Western blot检测图

GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
pull down实验报告
Western blot检测Pull down产物中的诱饵蛋白和待测蛋白Western blot检测图
GST pull down  MS       
构建诱饵蛋白的GST原核表达载体(可选做)

载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

约2周      

1、含有诱饵基因序列的质粒模板及测序文件

2、实验样本

3、实验信息表(样本信息、诱饵蛋白序列)

点击询价

原核表达诱饵蛋白并进行Western blot检测Western blot检测图

GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(3组:实验组、空载对照组、裂解液对照组)
pull down实验报告
Western blot检测pull down产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
LC-MS/MS定性检测pull down产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告1周



GST pull down技术服务优势*辉骏生物

1
近十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可
2
对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户情况提出合适的方案建议
3
自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线
4
自有蛋白质组学平台,对微量互作蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解
5
售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿



GST融合蛋白纯化实验结果示例

GST pull down试验服务结果分析

GST pull down WB:Western blot检测图(阳性)


GST-pull down外包实验服务结果分析

GST Pull-down MS:Western blot检测图


GST pull down实验服务费用价格实惠质量高

GST pulldown MS:质谱检索表格(部分展示)




GST融合蛋白纯化实验服务-辉骏生物客户文章


1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research.  2019,IF=9.727.
【研究内容】:前期研究表明,GYS2基因在HCC患者低表达,干扰GYS2基因表达导致肿瘤增殖转移。本研究通过融合表达GST-GYS2、His-p53、His-MDM2,并用GST-pull down方法,证实了MDM2与p53竞争性结合GYS2基因。相关的COIPChIP-qPCR等实验进一步阐明GYS2基因降低肿瘤增殖转移的机制。
使用相关技术: gst pulldown测定、GST-pull down质谱分析、GST标签蛋白


2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015,IF=14.467.
【研究内容】:Wnt/β-catenin信号在内皮细胞的血管生成活性中起重要作用。过表达实验表明,转录因子Bach1过表达可抑制后肢缺血小鼠的血管生成,并抑制Wnt3a刺激的血管生成反应和人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin靶基因的表达。Co-IP实验和gst pull-down分析表明,Bach1直接与TCF4结合,并减少β-catenin与TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血损伤后的血管生成的作用机制,为血管生成治疗或其他涉及Wnt/β-catenin通路异常调节的疾病提供了新的治疗靶点。
使用相关技术: GST 融合蛋白、GST pull-down实验、GST pull-down技术



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