中文标题：GYS2/p53负反馈环对HBV相关性肝细胞癌肿瘤生长的抑制作用

发表期刊：Cancer Research

中科院分区：1区

影响因子：13.312

发表时间：2018年8月

合作单位：中山大学肿瘤防治中心

运用技术：GST pull down WB，免疫共沉淀（Co-IP）（由辉骏生物提供技术支持）

● 研究背景

肝细胞癌(HCC)是全球第五大最流行的恶性肿瘤和第二大与癌症相关的死亡原因。它的发生归因于代谢物相关基因调控改变引起的细胞代谢重编程，有证据表明，糖代谢异常是癌症的突出特征，然而有关糖原调节的异常很少被研究。因此，明确这种异常代谢的机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。

● 研究结果

1. 肝细胞癌中糖原含量降低

研究者通过PAS染色分析发现肝癌组织中的糖原与非肿瘤组织相比明显减少(图1A)。对768例HCC患者组成的样本进行PAS染色，根据阳性染色比例将患者分为高PAS组和低PAS组，Kaplan-Meier分析显示低PS染色与总体生存情况不良相关(图1D)，多变量Cox回归模型进一步显示糖原含量是HCC总生存率的独立预后因素。这些数据表明，肝细胞癌中糖原合成受到抑制。 

图1

2. GYS2在肝细胞癌中降低，并与不良患者预后相关                           

8对肝癌组织的转录图谱显示，涉及糖原合成和代谢的基因被解除了调控。其中，GYS2在肿瘤组织中显著下调(图2A)。在HCC新鲜组织中，与匹配的非肿瘤组织(图2B)相比，近3/4的病例中GYS2 mRNA表达降低；GYS2蛋白水平在全部HCC标本中显著降低，并且与糖原含量呈正相关(图2C，D)；在63.0%(481/763)的HCC中，GYS2表达明显下调(图2E)。GYS2在60.6%(462/763)的HCC组织中低表达，常见于PAS染色较弱的病例(图2F)。Kaplan-Meier分析显示，GYS2缺乏的患者在SYSUCC和癌症基因组图谱中的总体存活率都不佳(图2G)。多变量Cox回归模型和分层生存分析进一步表明GYS2是影响HCC总生存率的独立预后因素。

图2

3. GYS2缺失促进肝癌体内外增殖

为了探讨GYS2在HCC中的生物学功能，研究者在HepG2和QGY-7703细胞中敲除GYS2，在Bel-7402和Bel-7404细胞中过表达GYS2(图3A)。细胞活力在GYS2沉默的细胞中显着增加，但在过表达GYS2的细胞中下降(图3B)。GYS2基因敲除可显著诱导EDU阳性细胞，而GYS2过表达可使EDU阳性细胞减少(图3C)。GYS2沉默后，细胞阻滞于S-G2-M期，而过表达GYS2则导致更多的细胞处于G0-G1期(图3D)。此外，GYS2缺失的细胞形成了更多的集落，而GYS2的异位表达削弱了HCC细胞的增殖(图3E)。为了在体内验证这些效应，研究者建立了裸鼠皮下注射细胞的异种移植模型。与对照组相比，GYS2沉默的荷瘤细胞生长更快，糖原含量更少，Ki-67表达更高(图3F)。这些发现表明，缺乏GYS2极大地促进了肝癌细胞的生长。

图3

4. GYS2激活p53信号通路

为了揭示GYS2介导的肝癌增殖的潜在机制，研究者在HepG2和QGY-7703细胞中进行了RNA seq分析。结果显示，在GYS2缺失的两种细胞系中，p53通路都受到了明显抑制(图4A)，GYS2的过表达诱导p53蛋白水平，导致p53靶基因的调控，如p21，14-3-3S和cyclin D1(图4B)。接下来研究者通过Co-IP研究了这两个蛋白之间的相互作用(图4C)，又通过GST pull-down实验证实了GYS2与p53的直接结合(图4D和E)。进一步确定相互作用的区域，结果显示，p53的1-101aa区和GYS2的1-500aa区是GYS2-p53结合所必需的(图4F和G)。为了验证GYS2是否通过p53发挥抗肝癌作用，研究者进行了挽救实验。恢复p53表达可部分减弱GYS2缺失对HepG2和QGY-7703细胞生长的促进作用。这些数据表明，GYS2在肝癌细胞中通过与p53的相互作用发挥肿瘤抑制作用。

图4

5. GYS2通过与MDM2的竞争性相互作用稳定p53

为探索GYS2上调p53的机制，研究者通过使用环己胺处理，发现GYS2过表达显著延长了肝癌细胞中p53蛋白的半衰期(图5A)。用蛋白酶体抑制剂MG-132预孵育细胞，Co-IP结果显示，泛素介导的p53蛋白酶体降解被GYS2沉默增强，但被异位GYS2表达减弱(图5B）。转染GYS2 siRNA，用MG-132预孵育后进行Co-IP实验，再次检测GYS2对p53泛素化的影响。结果显示MG132可取消GYS2 siRNA诱导的p53降低(图5C)。E3泛素连接酶MDM2在p53泛素化过程中起着关键作用，为确定MDM2是否参与了GYS2对p53的调控。研究者在MDM2诱导下，再次检测了GYS2对p53泛素化的影响。结果显示GYS2部分减弱了MDM2介导的p53泛素化，GYS2 siRNA阻断了MDM2 siRNA诱导的p53泛素化抑制(图5D)。用MDM2 siRNA处理细胞后再敲除GYS2，WB检测P53蛋白表达，结果显示SiRNA对MDM2的抑制显著抑制了GYS2 siRNA对p53的下调(图5E)。接下来，研究者通过Co-IP法检测了GYS2、MDM2和P53细胞中的相互作用(图5F)，结果所示，GYS2、p53和MDM2通过相互结合形成了蛋白质复合物。GST pull-down实验也证实了GYS2与MDM2的直接结合(图5G)。此外，MDM2和p53之间的相互作用因GYS2的下调而增强，但因GYS2在HCC细胞中的过表达而减少(图5H和I)。这些数据表明，GYS2通过竞争性地与MDM2结合来抑制p53泛素化从而稳定p53蛋白。

图5

6. P53通过依赖p300的负反馈环抑制GYS2

鉴于GYS2在p53介导的异常糖原代谢中的作用。qRT-PCR和WB分析检测GYS2 在p53过表达或沉默的情况下的表达，结果显示，p53的敲除上调了GYS2的mRNA和蛋白水平(图6B)。双荧光素酶分析表明，p53转染降低了GYS2启动子的活性(图6C)。CHIP分析也证实了p53与GYS2启动子结合(图6D)。p53的转录后修饰是其转录功能所必需的，p300介导的p53乙酰化增强了其反式激活靶的DNA结合能力。转染GYS2后检测4个p53乙酰化赖氨酸位点的表达，结果显示，GYS2过表达增加了赖氨酸373/382处的p53乙酰化(图6E)，这一作用被p300的敲除所阻断(图6F)。用特异性p300抑制剂C646或p300 siRNA处理细胞，可以消除p53介导的GYS2下降(图6G)。研究者进一步构建了不能被p300乙酰化的p53K373A和p53K382A突变，这两个p53突变体的转染导致GYS2 mRNA和蛋白的减少较少(图6H)，此外，在p53K373A或p53K382A表达的细胞中，p53对GYS2启动子的抑制作用和结合减弱(图6I和J)。这些结果表明，在负反馈环中，p53通过p300介导的乙酰化在转录上抑制GYS2。

图6

7. HBx-HDAC1复合物促进p53介导的GYS2抑制作用

HBV编码的关键致癌蛋白HBx在糖原代谢中的作用尚不明确。分别在HepG2细胞中过表达HBx，在HepG2.2.15细胞中敲除HBx，PAS染色显示糖原含量，结果显示HBx过表达减少了HCC细胞中的糖原含量，而HBx的敲除恢复了这一趋势(图7A)。在HBx阳性的病例中，GYS2的低表达和PAS染色更常见(图7B)，而在HBx阴性的HepG2和QGY-7703细胞中，引入HBx下调了GYS2的表达(图7C)。据报道，HBx的活性抑制需要招募协同因子，而组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是与HBx相互作用的主要基因抑制因子。研究者用siRNA处理HepG2.2.15和HepG2-HBx细胞，Co-IP实验显示了HBx、HDAC1和细胞核内乙酰化的p53之间的相互作用(图7D)。在HBx过表达的细胞中，HDAC1或p53的敲除部分减弱了GYS2 mRNA的减少(图7E)。荧光素酶和CHIP分析表明，HDAC1或p53的敲除降低了HBx与GYS2启动子的结合(图7F和G)。这些数据表明，HBx与HDAC1共同作用于p53介导的抑制HBV阳性肝癌中GYS2的表达。

图7

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