RNA pull down是体外条件下寻找目标RNA的结合蛋白的方法。使用体外转录法标记生物素RNA探针，将体外转录的RNA结合到Beads上，再将RNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样与目标RNA结合的蛋白便会一起吸附在Beads上。

洗涤掉不结合的蛋白后，用洗脱液将RNA-蛋白复合物从Beads洗脱下来，即RNA pull-down产物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。

这种互作复合物既可以用Western Blot检测特定的结合蛋白，还可以采用质谱方法鉴定与目标RNA结合的未知蛋白。

实验大致流程：RNA探针制备→总蛋白提取→磁珠预处理→RNA PullDown（磁珠-RNA探针复合物富集互作的蛋白）→蛋白洗脱→WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白

1 RNA探针制备

目前，体外RNA探针主要采用生物素标记，操作复杂且成本高。辉骏生物自主研发了一种用RNA标签“F2”来标记目标RNA探针的方法（已申请专利，已有文献引用），使标记更简单，成本更低。以下详细介绍下两种标记方法。

1.1 生物素标记的RNA探针制备

（1）构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证；

（2）体外转录模板准备：根据目标RNA序列设计带有T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物，以目标序列的DNA质粒为模板，PCR分别获得T7-正义RNA（实验组）和T7-反义RNA（对照组）转录模板，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书要求回收纯化目标DNA；

（3）体外转录：以上述DNA为模板，加入相应的RNA体外转录配置的反应体系（含生物素UTPs），37℃孵育2 h，再加入1 μL DNase I，37℃孵育15 min将DNA模板消化，得到正义和反义RNA；

（4）为了避免转录产物中的游离生物素UTP 竞争结合磁珠，此处最好采用 RNA 纯化试剂盒来处理转录产物，但此操作可能造成一定的产物损失，可以根据具体情况决定是否进行此步操作；

（5）使用Nanodrop（紫外分光光度计）检测RNA浓度，取1-2 μL RNA进行2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和长度；符合要求的 RNA 置于- 80℃保存或直接用于后续实验。

1.2 F2标记的RNA探针制备

（1）操作方法与生物素标记的RNA探针类似，但在制备DNA模板时，需要将17bp的F2序列一起加入到引物中。RNA体外转录体系则无需再加入生物素UTPs，节省了成本，后续也不需要进行RNA纯化操作，简化了操作步骤。

（2）以上述DNA为模板，加入相应的RNA体外转录配置的反应体系（无需再加生物素UTPs），37℃孵育2 h，再加入1 μL DNase I，37℃孵育15 min 将DNA模板消化，得到正义和反义RNA。

2️⃣当目标序列过短（＜300bp）或过长（＞4kb）时，探针制备难度将增加；长序列可以分段进行实验。

2 总蛋白提取

2.1 细胞样本

（1）培养目标细胞，待细胞生长至合适密度，收集细胞；

（2）用预冷PBS缓冲液清洗细胞2-3次，加入0.6-1 mL预冷的裂解缓冲液（辉骏货号：FI8101），在裂解液中预先加入6-10 μL蛋白酶抑制剂（辉骏货号：FI8105）、3-5 μL RNA酶抑制剂（辉骏货号：FI8106），现用现配；

（3）4℃混匀仪上裂解30 min或者冰上超声至溶液基本澄清（如果无超声条件，可置于冰上裂解30 min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5 s）；

（4）4℃离心机12000 rpm离心15 min，收集上清至新的1.5 mL无RNase EP管中；

（5）取30 μL作为input，剩余上清平分为两份用于RNA pull-down实验（记为实验组和对照组），置于冰上备用或-80℃保存。

2.2 组织样本

（1）采用预冷的PBS清洗新鲜组织，去除血液等成分；

（2）实验组和对照组分别取0.2-0.4 g干净的组织，用液氮在研钵中充分研磨，随后转移至预冷的无RNase、新的EP管中；

（3）将样本置于冰上，加入0.6-1 mL预冷的裂解缓冲液，在裂解液中预先加入6-10 μL蛋白酶抑制剂、3-5 μL RNA酶抑制剂，吹打混匀，现用现配；

（4）4℃混匀仪上裂解30 min或者冰上超声至溶液基本澄清；

（5）4℃离心机12000 rpm离心15 min，收集上清至新的1.5 mL无RNase EP管中；

（6）取30 μL作为input，剩余上清平分为两份用于RNA pull-down实验（记为实验组和对照组），置于冰上备用或- 80℃保存。

3 磁珠预处理

(1) 将链霉亲和素磁珠（辉骏货号：FI8303）上下颠倒混匀，取实验组和对照组一共所需的80 μL 磁珠到新的无RNase EP管中；

(2) 加入1 mL NT2缓冲液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1 min 并弃上清；

(3) 重复上步操作一次；

(4) 加入400 μL NT2缓冲液，上下颠倒重悬磁珠；

(5) 将磁珠平分为两份，每组各约200 μL，转移到新的无 RNase EP管中，记为实验组和对照组。

4 RNA pull-down

(1) 取实验组和对照组RNA探针各3 μg，95℃加热变性3 min，冰浴1 min，瞬离，向管中加入50 μL RNA结构缓冲液，室温放置30 min；

(2) 将RNA探针分别加入对应的磁珠中，混匀仪上室温孵育30 min；

(3) 放磁力架上静置1 min，并弃上清；

(4) 每组加入500 μL漂洗液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1 min，并弃上清；

(5) 重复上步操作一次；

(6) 加入相应组别的样本裂解液，混匀仪上4℃孵育2~4 h；

(7) 放磁力架上静置1 min 并弃上清；

(8) 每组加入 500 μL 漂洗液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1 min 并弃上清；

(9) 重复上步漂洗操作两次，共漂洗三次，保留磁珠。

5 蛋白洗脱

5.1 变性洗脱

（1）向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液进行洗脱，振荡混匀后瞬离，95℃加热5-10 min；

（2）放磁力架静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，进行SDS-PAGE或Western Blot检测，如果需要进行质谱检测，则切胶条后送检。

5.2 非变性洗脱 

（1）向磁珠中加入50 µL洗脱缓冲液（辉骏货号为：FI8102），涡旋振荡20 s，放混匀仪上室温洗脱10-15 min，涡旋振荡20 s；

（2）1000 g离心20 s，放磁力架上静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脱后的蛋白-80℃保存，或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和质谱等实验。

2️⃣RNA pull-down捕获的蛋白量通常较少，因此SDS-PAGE胶建议用硝酸银染色，检测富集蛋白的情况。

6 WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白

6.1 WB检测是否存在靶蛋白

通过蛋白印迹(Western Blot)技术使用Anti-Prey对沉淀中的蛋白质进行检测，若能够检测在目标RNA沉淀中有清晰Prey条带，则说明存在特异性相互作用。

6.2 质谱鉴定洗脱液中的蛋白

通过质谱鉴定实验组与对照组的差异蛋白，进而筛选可能的互作蛋白。

Input组（阳性对照组）：样本裂解液；

Antisense（对照组）：目标RNA反义链探针的pull-down产物；

Sense（实验组）：目标RNA正义链探针的pull-down产物。

先看Input组：验证Input组需检测到待测蛋白（Prey）条带。若Input组无信号，说明样本中待测蛋白未提取成功或浓度过低，后续Sense组和 Antisense组的结果无意义，需重新优化蛋白提取步骤。

再比较Sense组与Antisense组：判断特异性相互作用。若Sense组检测到待测蛋白（Prey）条带，且Antisense组无条带或条带极弱，说明目标RNA正义链能特异性结合待测蛋白，可判定二者存在相互作用。

RNA pulldown实验验证目标RNA与待测蛋白（Prey）是否存在相互作用，如果最终的结果Sense组有条带，则可以证明之间存在相互关系。上图为RNA pull-down阳性结果示意图：表明目标RNA可以与Prey蛋白结合，存在相互作用。

✅注意：

2️⃣如果Sense组与Antisense组均未检测到待测蛋白信号：需先确认Input组是否有信号，若Input组有信号则可能是探针与蛋白结合效率低（如探针标记失败、孵育条件不当），需排查探针制备或孵育步骤。

1 RNA pull down试剂盒

2 RNA pull down实验服务

如果您在做RNA pulldown实验上还有疑问，欢迎咨询我们的技术人员：400-699-1663。

辉骏生物还提供各种类型蛋白互作试剂盒以及互作实验服务（IP、RIP、RNA pull down、ChIP、DNA pull down实验），可根据实验需求定进行选择，助力您的科研更高效、更精准！