GST pull-down是体外验证蛋白直接互作的核心技术，实验设计尤其是对照组设置是实验难点。该实验易受非特异性结合、GST标签自吸附干扰，严谨对照是排除干扰、满足论文审稿要求的关键。辉骏生物将从实验原理、对照设计、实验流程、文献应用；四方面详解GST pull down。

GST pull-down是什么？

GST pulldown 利用标签‑配体的亲和作用，在体外纯化带标签的目的蛋白，与裂解液孵育形成互作复合物，再通过亲和介质富集该复合物。

GST pull-down

• 目的：体外验证蛋白和蛋白之间的直接相互作用。

• 优点：
  

  ①在样本无IP级别抗体，且不能做标签抗体验证时首选；

  ②可以验证两个蛋白是否为直接互作；

  ③可以与Co-IP或酵母双杂共同验证一个问题。

• 缺点：
  

  ①构建载体,诱导表达蛋白；

  ②体外表达，非真实结合；

  ③难以检测弱互作或瞬时互作。

注意：特别适用于强互作蛋白，也很适合研究蛋白间的直接相互作用。

GST pull-down实验对照

实验组为GST‑X融合蛋白，对照组为GST空载体蛋白。 各取菌体裂解液作为Input，检测蛋白表达与条带位置， 两组在相同条件下与含His‑Y的裂解液孵育。

• Input对照

  目的：验证GST-X融合蛋白体外表达成功，并确认互作蛋白共同表达。

• 对照组（阴性对照）—GST蛋白
  

  目的：表达GST空载蛋白与His-Y蛋白待测样本，采用GST纯化树脂（辉骏货号：FI8304）进行pulldown实验，目的是为了排除GST 标签自身与诱饵蛋白的非特异性结合，避免因标签干扰造成的假阳性结果。

• 实验组—GST-X融合蛋白
  

  目的：表达GST-X融合蛋白与His-Y蛋白待测样本，采用GST纯化树脂进行pull-down实验，检测其与待测蛋白之间的特异性相互作用，明确两种蛋白是否存在结合关系。

• 可选对照：流穿液检测
  

  目的：收集与GST纯化树脂孵育后的上清液，通过蛋白定量或电泳检测，评估GST融合靶蛋白的富集效率，判断实验体系的有效性。

结果图中 “+” 为加该蛋白，“-” 为不加。Input 均有条带，说明蛋白表达正常。若 pull‑down 洗脱液出现 His‑Y 条带，即证明 GST‑X 与 His‑Y 存在直接相互作用。

GST pull-down实验流程

实验流程：GST诱饵蛋白诱导表达、制备纯化，待测样本制备后进行GST pull down，最终用WB或质谱鉴定洗脱液蛋白。

体外表达带标签诱饵蛋白并纯化，与样本裂解液孵育，漂洗去未结合蛋白后洗脱，通过WB或质谱检测洗脱液中互作蛋白。

ps：辉骏生物自有质谱检测平台，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析

GST pull-down文献解读

1.GST pull-down验证蛋白是否存在直接相互作用

从图中可以看到Lysate（即Input组）所有转染组均出现对应蛋白条带，说明目的蛋白均成功表达，而且可以看到GSNOR蛋白加了GST-tag，比单纯的GST标签蛋白分子量要高很多。

泳道① GST-vector蛋白+Myc-NEDD4为对照组，泳道② GST-GSNOR蛋白+Myc-NEDD4为实验组。泳道①、②是利用GST-Pulldown拉下来的复合物，泳道②的GST-GSNOR蛋白能够下拉到His-CsATG8c蛋白，因此通过GST pull-down证明了GST-GSNOR蛋白与Myc-NEDD4蛋白存在直接相互作用。

2.GST pull-down验证两个蛋白结合的结构域

对照组用的是GST空载蛋白，实验组是GST-USP5融合蛋白的全长及不同截短体。从图中可以看到WCL（即Input组）检测到HA蛋白条带，从银染胶上也可以看到纯化后GST蛋白和GST-USP5融合蛋白的全长和截短体条带，说明蛋白均成功表达。

就可以往下看pull down，这里是用GST纯化树脂进行pull-down，发现GST-USP5全长能够富集到HA蛋白条带，说明GST-USP5与PD-1-cHA蛋白存在直接相互作用。而缺失GST-USP5的UBA1/2这一段发现条带消失，说明GST-USP5的UBA1/2这一段是与PD-1-cHA蛋白结合区域。

辉骏生物GST pull-down试剂盒—客户应用案例

2025年7月23日，重医基础医学院赵明明/宋晶团队在Nature Communications发表论文，探讨了DSS1在ccRCC转移中的关键作用及分子机制，为其治疗提供新思路。

作者通过GST pull down实验（由辉骏生物提供试剂盒）进行DSS1与LC3蛋白、TRIM25与LC3蛋白相互作用验证，发现DSS1与LC3蛋白，TRIM25与LC3蛋白均存在直接相互作用（详见图1a、b）。

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