中文标题：lPRMT1介导的UBAP2L精氨酸甲基化调控应激颗粒组装

发表期刊：Cell Death & Differentiation

影响因子：12.067

发表时间：2020年

合作单位：南方医科大学

运用技术：LC-MS/MS蛋白质谱鉴定（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

应激颗粒(SG)是真核细胞遇到环境胁迫时形成的停滞信使核糖核蛋白复合体(MRNP)的离散集合。RNA结合蛋白(RBP)通过招募mRNP群体来调节它们的凝聚。然而，有关泛素相关蛋白2样蛋白(UBAP2L)在SG动态调控中的细胞和分子机制仍不清楚。

● 研究结果

1. UBAP2L参与SG组装

研究者将FLAG-UBAP2L或FLAG空载体转染HEK293细胞，用FLAG一抗进行Co-IP。质谱法分析FLAG-UBAP2L组和FLAG组之间的差异条带。其中3个沉淀蛋白被鉴定为脆性X智力低下综合征相关蛋白2(FXR2)、FXR1和ras GTPase激活蛋白结合蛋白2(G3BP2)(图1A)。互作实验表明UBAP2L与FXR1、FXR2和G3BP2相互作用（图1B-D）。由于FXR1、FXR2和G3BP2参与了SG的形成，研究者进一步调查了UBAP2L是否也参与了这一细胞过程。用5种不同的SG诱导剂刺激HeLa细胞，对UBAP2L及其结合伙伴G3BP或FXR1进行联合IF分析，以确定UBAP2L在不同应激条件下参与SG的情况。结果表明UBAP2L不参与克霉唑（CZ）诱导的SG(图1E)。在HeLa细胞中UBAP2L和FXR1的Co-IF分析中也得到了类似的结果(图1F)。这些结果表明，UBAP2L参与了多种化学物质诱导的SG的形成。

图1

2. UBAP2L调节SG动态

通过G3BP和eIF4G(另一个典型的SG成分)作为标记(图2A、C和E)，敲除UBAP2L后，AS、H2O2和山梨醇诱导的SG的形成显著减少。此外，在UBAP2L基因敲除后，去除AS后SG的检测率略高于应激组，这表明UBAP2L基因敲除延缓了SG的降解。这些结果表明，UBAP2L基因敲除不仅抑制了应激诱导的SG组装，而且延缓了应力消除后SG的拆解。UBAP2L过表达促进了H2O2诱导的SG组装，NC组和RNAi组在去除H2O2后SG的形成都显示出2倍以上的增加(图2B，D和E)。这些结果表明，UBAP2L是SG动力学的关键调节器，是SG组装和拆卸所必需的。

图2

3. UBAP2L对SG核仁与40S核糖体亚基相互作用的影响

接下来，研究者探究了UBAP2L介导SG组装的机制。WB分析显示，无论在有无应激刺激的情况下，UBAP2L蛋白水平都保持相对稳定(图3A)。此外，UBAP2L敲除(图3B)或过表达(图3C)都并没有改变其他SG蛋白的蛋白质水平。这表明UBAP2L介导的SG动态调控不涉及UBAP2L本身或其他SG蛋白表达的变化。因此，研究者探究了UBAP2L影响SG核蛋白或40S核糖体亚基[例如核糖体蛋白(RP)S6]之间的相互作用。结果显示，在正常和AS条件下，UBAP2L基因敲除抑制了G3BP2与PABPC1或RPS6之间的相互作用（图3D）。加入RNaseA后，G3BP2与PABPC1的结合减弱，而与RPS6的结合增强，UBAP2L基因敲除后G3BP2与PABPC1的结合也减弱。这些结果表明，UBAP2L影响SG核仁与40S核糖体亚基之间的相互作用，提示着UBAP2L调控SG动态的机制。

图3

4. SG组装需要UBAP2L中的RGG基序

UBAP2L包含一个UBA结构域，一个RGG基序，三个具有预测mRNA结合活性的区域，以及一个未知功能域。这些特征赋予了UBAP2L成核SG形成的能力。因此，我们检测到UBAP2L与其他已知的SG核蛋白或核糖体亚基的潜在联系。结果显示，UBAP2L在正常条件下与G3BP1、G3BP2和PABPC1结合，这些相互作用在AS处理后略有下降。UBAP2L与核酸体的结合是RNA依赖性的，因为它们的结合在RNase处理后完全消失，而它对核糖体解离的EDTA-EGTA(EE)或稳定核糖体的Mg2+具有抗性。正常情况下，UBAP2L与小的40S亚基蛋白RPS6结合，而不与大的60S亚基RPL4结合，表明UBAP2L优先与40S亚基结合，而不是60S核糖体亚基。UBAP2L直接与EE解离的40S和60S亚基中的RPS结合，而在Mg2+稳定的完整80S核糖体中不能与RPS结合，但不与亚基中的rRNA结合。为了进一步定位UBAP2L中负责这些关联的结构域，用标记的UBAP2L-野生型(WT)或缺失体转染HEK293细胞，Co-IP/WB分析UBAP2L缺失与SG蛋白的相关性。结果表明，RGG基序是UBAP2L通过招募其他核因子和核糖体亚基形成SG所普遍需要的，而DUF结构域介导了UBAP2L和G3BP之间的分子相互作用，从而协同促进了SG的成核。接下来，研究者探究了每个结构域在具有稳定UBAP2L下调的HeLa细胞中SG凝聚中的作用。结果表明，在正常条件下，UBAP2L-WT的瞬时过表达诱导了SG的形成，这表明UBAP2L的过表达导致了SG的成核。UBAP2L RGG在正常情况下显示出散在的胞浆定位，并在AS处理后完全排除在G3BP2组装之外(图4C，D)，这证实了RGG基序在UBAP2L SG能力中的重要作用。DUF结构域的缺失导致UBAP2L从细胞质穿梭到细胞核(图4C)，表明去除DUF结构域增加了核UBAP2L水平，降低了UBAP2L细胞质表达。研究者还观察到G3BP1/2的适度胞质-细胞核易位(图4E)。然而，在G3BP1/2双敲除后没有观察到这种UBAP2L核转位(图4F)，UBAP2L基因敲除也未能诱导G3BP移位到细胞核中(图2A)，表明UBAP2L表达并不负责将G3BP保留在细胞质中，而DUF结构域充当了这一角色。

图4

5. UBAP2L中的RGG基序被PRMT1不对称地甲基化

Co-IP/MS分析还确定了UBAP2L的另一个相互作用伙伴，PRMT1(图5A，B)。体外甲基化试验表明，UBAP2L被PRMT1二甲基化(图5C)。RGG结构域的缺失取消了UBAP2L与PRMT1的相互作用以及ADMA信号，而UBA结构域的删除显著地加强了他们之间的联系(图5D)。这些结果表明，UBAP2L中的RGG基序是PRMT1的独特靶区。为了证实RGG基序中的精氨酸残基被PRMT1甲基化，研究者特别设计了UBAP2L结构，其中RGG基序中的所有精氨酸残基都突变为丙氨酸(UBAP2L-R131-190A)或赖氨酸(UBAP2L-R131-190K)，丙氨酸取代被用来测试精氨酸残基的生物学作用，而赖氨酸取代被用来测试不对称二甲基官能团的作用。结果表明，PRMT1只针对UBAP2LWT，而不是UBAP2L-R131-190A或UBAP2L-R131-190K突变体(图5e)，AS处理降低了UBAP2L-WT与PRMT1的相互作用，以及ADMA水平(图5e)，表明胁迫降低了UBAP2L甲基化。接下来研究者评估了精氨酸甲基化和SG形成之间的关系，UBAP2L-R131-190K与UBAP2L-WT的SG能力相当，而UBAP2L-R131-190A则显示出明显的SG缺乏(图5F，G)。然而，在正常或胁迫条件下，SG的形成都没有明显的变化(图5H和I)，仍然检测到PRMT1结合和ADMA信号(图5J)。这些数据表明，UBAP2L中的RGG基序被PRMT1不对称地甲基化。

图5

6. UBAP2L中精氨酸甲基化减少促进SG组装

基于以上结果，研究者推测UBAP2L中精氨酸甲基化水平的降低促进了SG的组装。基因敲除实验显示，PRMT1敲除显著促进了UBAP2L-WT诱导的HeLa细胞中SG的形成，而PRMT1过表达则显著抑制了SG的形成。在用PAN甲基转移酶抑制剂腺苷二醛(ADOx)处理的细胞中，UBAP2L-WT组，而不是UBAP2L-R131-190K组，显示出比对照组明显更多的SG(图6A，B)。这表明UBAP2L精氨酸甲基化抑制了SG的组装，而它的减少促进了SG的组装。最后，研究者进行了应激恢复实验，以监测UBAP2L在整个治疗和恢复期的甲基化状态。随着压力增加，eIF2α磷酸化增加，随后在恢复后随时间降解(图6D)，UBAP2L上的PRMT1结合和ADMA水平也均随着治疗降低。在恢复期间，UBAP2L由PRMT1逐渐与ADMA甲基化(图6D)。这表明，应激降低了UBAP2L甲基化，在应激恢复过程中，UBAP2L甲基化再次增加。这些结果表明，PRMT1是一个重要的分子开关，通过监测UBAP2L精氨酸甲基化在SG的动态调节中发挥作用。

图6