中文标题：P300/YY1/miR-500A-5p/HDAC2信号轴调节结直肠癌癌细胞增殖

发表期刊：Nature Communications

中科院分区：1区

影响因子：17.694

发表时间：2019年

合作单位：南方医科大学

运用技术：LC-MS/MS蛋白质谱鉴定（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

结直肠癌(CRC)是全球癌症相关性死亡的主要原因之一，复发率和转移率较高。阐明CRC发生和转移的机制将有助于寻找新的诊断生物标志物和开发有效的治疗干预措施。在过去的研究中已经发现了一些参与结直肠癌形成和发展的蛋白质编码基因，然而，包括microRNA(MiRNA)在内的非编码RNA的功能在很大程度上仍需进一步研究。

● 研究结果

1. miR-500a-5p在CRC中被下调

研究者通过阵列分析确定了人类正常结肠上皮FHC细胞和人类结肠癌细胞系SW620和LoVo中的总体miR表达。在这些差异表达的miR中，有十七个miR在SW620和LoVo细胞中共享相似的表达模式（图1A）。其中，miR-500a-5p引起了研究者的注意。研究者检测了miR-500a-5p在9个细胞系中以及81对人类CRC组织和匹配的非肿瘤组织中的表达水平。结果显示，与正常人肠上皮FHC和NCM460细胞相比，SW480，DLD1，SW1116，SW620，HCT116，LoVo和Caco2细胞中的miR-500a-5p水平显著降低。此外在64个CRC样本中，miR-500a-5p的表达下调了7.67倍（图1C）。与邻近的正常结肠粘膜组织相比，其在CRC患者组织中的表达明显降低（图1D）。原位杂交（ISH）显示它位于CRC细胞的细胞核和细胞质中（图1E）。此外，研究者将患者按照低表达/高表达分组 ，Kaplan–Meier生存曲线分析结果表明，miR-500a-5p表达低的442例结肠癌患者的总体生存期较短。这些发现表明，在CRC细胞中miR-500a5p的表达下调，且miR-500a-5p的低表达与CRC患者的不良生存率有关。

图1

2. miR-500a-5p的表达减弱了CRC的恶性进展

为确定miR500a-5p表达的临床相关性，研究者首先评估了CRC的临床病理特征，结果显示miR-500a5p的低表达与CRC的恶性进展有关。为探讨miR-500A-5P在CRC发展中的作用，研究者分别用miR-500a-5p模拟物和miR500a-5p抑制剂转染极低水平miR500a-5p的CRC细胞和正常人的结肠上皮细胞。克隆形成实验和EDU实验结果表明，miR-500A-5p在CRC细胞中的表达增加，导致细胞增殖受到抑制（图1F-I）。FACS分析、伤口愈合和跨孔侵袭实验也进一步表明，miR-500A-5P对CRC细胞的恶性特性有抑制作用。

图2

3. HDAC2是miR-500A-5P的一个功能性靶标

生物信息学分析结果显示，在微阵列和生物信息学数据之间有66个基因重叠(图2A)。其中，含有HDAC2基因的60个基因在miR-500A-5P过表达细胞中与对照细胞相比显著下调(图2B)。研究者通过WB和miRNA分析研究了潜在靶基因HDAC2与miR-500A-5p表达之间的相关性，结果显示与相应的非癌对照组相比，癌组织的HDAC2蛋白表达水平较高，而miR-500A-5p的表达水平较低(图2C，D)。此外，81例患者的CRC标本中HDAC2的mRNA水平与miR500a-5p的表达水平呈负相关(图2E)。荧光素酶报告分析实验结果表明，miR-500A-5p与miR-500A-5p模拟物共转染HDAC2-WT3ʹ-UTR后，荧光素酶活性降低。这两个位点中的任何一个突变都取消了miR-500A-5P对荧光素酶活性的抑制作用(图3A，B)，进一步证实了HDAC2是miR500a-5p的靶基因。WB分析转染miR-500A-5p模拟物或抑制剂的结肠上皮细胞中HDAC2蛋白的表达，结果表明，与m-NC细胞相比，该蛋白在转染miR-500a-5p模拟物的CRC细胞中表达下调，而在正常人结肠上皮细胞FHC和NCM460中表达上调(图3C)。克隆形成、WST-1和Transwell实验表明，HDAC2的过表达可以部分消除miR-500a-5p对细胞的抑制作用(图3D-F)。这些结果表明，miR-500A-5p通过下调HDAC2的表达来抑制CRC的发生和发展。

图3

4. miR-500A-5P通过靶向HDAC2在体内抑制CRC细胞的生长

为了评价miR-500A-5p对裸鼠体内肿瘤生长的影响，研究者进行了小鼠异种移植模型实验(图4A)。结果显示，注射LoVo/miR-500A-5p细胞的小鼠的肿瘤比注射LoVo/m-NC细胞的小。此外，注射LoVo/HDAC2细胞的小鼠比注射LoVo/Vector和LoVo/miR-500A-5p细胞的小鼠形成了更大的肿瘤，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2细胞形成的异种移植瘤比LoVo/HDAC2细胞小(图4A，B)。接下来，研究者检测了五组移植瘤中细胞增殖(Ki-67)和血管生成(CD105)标志物的蛋白表达。IHC染色分析结果显示，与LoVo/m-NC组相比，LoVo/miR-500A-5p组的增殖率和肿瘤血管密度显著降低(图4C-F）。此外，LoVo/HDAC2组与LoVo/Vector组和LoVo/miR-500a5p细胞组相比生长迅速，肿瘤血管密度增加，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2组抑制了LoVo/HDAC2组的生长速度和肿瘤血管密度(图4D，F)，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2组的生长速度和肿瘤血管密度均低于LoVo/Vector组和LoVo/miR-500a5p细胞组(图4D，F)。这些数据证实了miR-500A-5P下调了HDAC2介导的小鼠CRC细胞的生长。

图4

5. MIR-500A-5P受转录因子YY1负调控

研究者分析了miR-500A-5P基因上游1kb的基因组DNA序列。本实验表明，miR-500A-5p启动子(p-Luc-1kb)能够驱动荧光素酶的表达。因此，miR-500A-5P的表达是由其自身的启动子驱动的。一些研究表明转录因子YY1与HDAC相互作用，因此研究者研究了转录因子YY1是否能调节CRC细胞中miR-500A-5p的表达。CONSITE软件分析结果显示，YY1的三个最可能的结合基序位于−327至−333、−622至−628和−741至−747区域(图5A，B)。双荧光素酶试验表明，YY1细胞中miR-500A-5p位点1、2和3的活性比载体细胞降低2.5倍以上(图5C)。为了证实YY1在体内能够与miR-500A-5P启动子物理结合，研究者在表达外源YY1的CRC细胞中进行了ChIP-qPCR检测。用抗YY1抗体进行免疫沉淀后，3个YY1结合位点的miR-500A-5p启动子区域均有明显的富集(图5D)。

研究者进一步分析了YY1和miR-500A-5p在10例新鲜收集的CRC活检组织中的表达情况。结果显示与相应的非癌对照相比，癌症组织显示出更高的YY1蛋白表达，而miR-500A-5p的表达则降低(图5E)。YY1mRNA表达与miR-500A-5p表达呈负相关(图5F)。此外，YY1的瞬时表达不仅导致了miR-500A-5p的成熟形式，也导致了miR-500A-5p的前体或初级转录本在LoVo和SW620细胞中的表达减少(图5G)。研究者还评估了HDAC2或YY1的表达与相同临床病理参数之间的关系。结果表明，HDAC2和YY1的表达与CRC分化程度、淋巴结转移和TNM分期显著相关。最后，采用免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)方法检测基因表达。结果显示，miR-500A-5p在CRC组织中的表达明显低于癌旁正常组织，免疫组化显示CRC组织中HDAC2和YY1的表达明显高于癌旁正常组织。miR-500A-5p的表达与HDAC2或YY1呈负相关（图5H）。这些结果表明，YY1下调了CRC细胞miR500a-5p的表达水平，从而影响了YY1-miR500a-5p-HDAC2通路的功能。 

图5

6. 在CRC细胞中，miR-500A-5p表达的恢复是通过YY1/p300/HDAC2复合体上调的

研究者将HA标记的p300转染到CRC细胞中，检测p300蛋白是否与HDAC2或YY1相互作用。结果表明，抗HA(P300)抗体可以从细胞提取物中共沉淀HDAC2和YY1(图6A)。同样，HA(P300)或YY1用抗HDAC2抗体进行免疫共沉淀(图6B)。为进一步证实HDAC2-p300-YY1复合体的形成，研究者使用内源蛋白进行了免疫共沉淀实验。抗p300抗体可以从CRC细胞提取物中共沉淀HDAC2和YY1(图6C)。类似地，p300和YY1都被抗HDAC2抗体(图6D)免疫共沉淀，这表明这三种蛋白很可能在体内以复合物的形式存在。为了探讨miR-500A-5P分子与YY1/p300/HDAC2复合体的关系，分别将载体YY1、HDAC2和p300的表达质粒与YY1+p300、HDAC2+p300和YY1+HDAC2+p300联合转染CRC细胞，结果表明，p300过表达促进miR-500a5p的表达，而YY1或HDAC2则抑制miR-500a5p的表达。此外，p300与HDAC2和/或YY1协同作用可抑制CRC细胞miR-500A-5p的表达(图6E)，表明YY1或HDAC2与p300有拮抗作用，从而抑制miR-500A-5p的表达。

接下来，研究者将YY1、HDAC2和p300表达质粒分别单独或与YY1+p300、HDAC2+p300和YY1+HDAC2+p300共转染到报告基因质粒pGL3-miR-500A-5p上，结果表明YY1和HDAC2单独表达对miR-500A-5p有明显的抑制作用，而p300的异位表达则刺激miR-500a-5p的表达。当HDAC2+p300、YY1+p300或HDAC2+p300+YY1共转染时，发现与p300共转染可减缓对HDAC2或/和YY1的miR-500a5p转录活性的降低(图6F)。ChIP实验证明了YY1与miR-500A-5p启动子区域的结合与LoVo和SW620细胞中三个YY1结合位点的HDAC2和p300相关。过表达/敲除实验表明，YY1的过表达增加了YY1与miR-500A-5P位点1、2和3近端启动子的结合。此外，在CRC细胞中，p300的瞬时转染减少，而HDAC2的过表达增加，YY1与miR-500A-5p启动子的结合(图6G)。相反，YY1基因敲除降低了YY1与miR-500A-5p启动子的结合。这些结果表明，在CRC细胞中miR-500a5p的过表达是通过YY1/p300/HDAC2复合体上调的。

图6

7. 治疗性传递miR-500A-5P能够抑制异种移植瘤和FK228治疗的CRC肿瘤发展

细胞凋亡实验结果显示，miR-500A-5P比对照组更能诱导LoVo细胞凋亡。为探讨miR-500A-5p在细胞对HDAC抑制剂FK228介导的细胞凋亡敏感性中的作用，研究者用FK228处理细胞，流式细胞分析显示，转染miR-500A-5p+FK228的细胞凋亡率明显高于miR-500A-5p(图7A)。这些结果表明miR-500A-5P在体外可促进肿瘤细胞的凋亡，并增强肿瘤细胞对FK228诱导的凋亡诱因的敏感性。为了探讨miR-500A-5P对CRC的治疗潜力，研究者建立了异种移植小鼠模型和FK228处理的CRC模型。结果显示，注射LoVo细胞39天后，miR-500A-5P和miR-500A-5P+FK228组小鼠的肿瘤体积明显小于MNC组（图7C，D）。TUNEL染色显示，联合注射miR-500A-5P和FK228的肿瘤细胞凋亡率最高(图7E)。这些发现提示miR500a-5p增强了癌细胞对HDAC抑制剂FK228诱导的凋亡触发器的敏感性。以上结果表明，miR-500A-5P具有肿瘤抑制作用，具有治疗CRC的潜力。

图7

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