背景：

慢性病毒感染和肿瘤微环境可促使病毒特异性或肿瘤特异性T细胞耗尽，导致其增殖能力和效应功能严重受损，使免疫反应无法清除病毒或排斥肿瘤。T细胞共抑制受体最被认为是慢性病毒感染和肿瘤背景下T细胞耗竭的关键调节因子。对抗T细胞衰竭的癌症免疫治疗的关键点在于成功阻断共抑制信号，从而重新激活免疫反应。然而，慢性病毒感染、肿瘤发生和共抑制配体表达之间的相互作用仍尚不明确。

内容概述：
2018年3月，辉骏生物合作伙伴，中国科学院先天免疫与慢性病重点实验室在国际期刊Nature Communications（IF₂₀₁₇=12.353）上发表题为“Oncofetal gene SALL4 reactivation by hepatitis B virus counteracts miR-200c in PD-L1-induced T cell exhaustion”的最新论文。这项研究发现HBV相关性肝细胞癌患者肿瘤中的SALL4或PD-L1表达与miR-200C水平呈负相关，且SALL4或PD-L1水平低而miR-200C水平高的患者生存期较长。高水平的miR-200C直接靶向CD274 (编码PD-L1)来降低其表达，并逆转抗病毒CD8+T细胞的耗竭。作者发现，成年期HBV诱导导致STAT3激活，使SALL4蛋白重新表达，从而抑制miR-200c转录。HBV-pSTAT3-SALL4-miR-200C信号通路可调节PD-L1的表达，针对该通路的治疗策略可能会逆转病毒诱导的免疫衰竭。

主要技术：
ChIP、慢病毒、双荧光素酶报告基因、基因过表达/干扰等；
辉骏生物为本研究提供了shRNA慢病毒载体构建服务。

研究路线：

 
研究结果：
1. 肝癌组织中SALL4和PD-L1与miR-200C呈负相关
PD-L1在多种恶性肿瘤中起着重要作用，微阵列分析表明miR-200c是HCC标志物之一，此外，SALL4在HCC中高表达且与不良预后有关。miRNA分析工具显示miR-200c能结合PD-L1的3’UTR，另外，miR-200C的启动子区域预测有转录因子SALL家族的3个结合位点 (图1A)。研究者为了分析PD-L1，SALL4和miR-200C三者之间的关系，选取了98例肝癌患者的肿瘤组织，通过免疫组化染色和原位杂交方法分别检测肿瘤中心和周围区域PD-L1，SALL4和miR-200C的表达水平，发现三者表达均显著高于癌旁(图1C-E)，不过SALL4或PD-L1的表达高得多，且表达水平相当，而miR-200c相对较低，这说明SALL4、PD-L1和miR-200C在HCC进展过程中可能有密切关系。研究者分析了每个HCC患者肿瘤中心区域SALL4、miR-200C和PD-L1表达之间的关系，发现miR-200c与SALL4或PDL1的表达呈负相关(图2A，E)。研究者还检测了可能影响PD-L1的miR-200a和miR-383的水平，未分析它们与肝癌患者SALL4和PD-L1表达的关系。说明miR-200家族与SAL4或PDL1之间的负相关对miR-200c来说是更特异的（图1）。

                 
                                                                                             （图1）
 

                  
                                                                                            （图2）

2. SALL4和miR-200c与总生存期相关
PD-L1与预后的相关性已经在几种人类癌症中得到证实，基于SALL4和miR-200c与PD-L1表达有相关性，作者评估了SALL4和miR-200c的潜在预后价值。统计学分析表明，正如预期一样，PD-L1在肿瘤中心的表达与总生存率（OS）呈负相关，癌旁无相关性(图3A-C)。在同一肝癌组中，肿瘤中心和癌旁的miR-200c水平与OS也存在正相关(图3D-F)。与PD-L1相似，SALL4在肿瘤中心的表达与OS呈负相关，癌旁无相关性(图3G-I) 。综合分析表明SALL4或miR-200c在肿瘤中心区的水平有重要的预后价值，可能成为肝癌生存预测指标。

3. miR-200c下调HBV诱导的PD-L1表达
HBV慢性感染是肝细胞癌变的关键因素，为了检查其潜在机制，作者使用HBV感染人肝细胞系HLCZ01，发现PD-L1在HBV感染细胞中的水平显著高于未感染细胞；另外，通过向小鼠体内注射pAAV/HBV1.2质粒制备HBV感染小鼠模型，发现PDL1的水平也显著高于未感染小鼠。
作者在HBV感染的HLCZ01细胞中分别转染miR-200c、miR-200a和miR-383的模拟物或抑制剂，并检测PD-L1水平，结果显示miR-200c模拟物或抑制剂分别可抑制或促进PD-L1表达，而miR-200a和miR-383都不影响PD-L1水平(图4A)；并且miR-200c对PD-L1表达的影响呈剂量依赖性(图4B)。研究者采用双荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-200c是否直接靶向PD-L1的3ʹUTR，结果显示，miR-200C模拟物显著降低荧光素酶活性，而miR-200C抑制剂显著增强荧光素酶活性（图4C），表明miR-200c直接靶向PD-L1。为了探讨miR-200c是否拮抗HBV对PD-L1表达的影响，作者用HBV感染HLCZ01细胞，发现miR-200c的表达被显著抑制(图4D)。另一方面，将miR-200c模拟物转染到HBV阳性的HLCZ01细胞中，发现miR-200c几乎完全阻断了HBV介导的PD-L1表达的上调，表明miR-200c可抑制HBV介导的PD-L1上调(图4E)。构建miR-200c过表达载体并注射到HBV持续感染的小鼠体内，发现miR-200c的过表达显著减弱了HBV诱导的肝细胞PD-L1表达的上调(图4G,H)。这些结果表明，HBV和miR-200c相互拮抗影响PD-L1表达。
 

4. miR-200c逆转HBV阳性小鼠CD8+T细胞耗竭
结合之前的报道，为进一步证实肝细胞上PD-L1的升高会损害肝脏CD8+T细胞的活化，研究者构建了小鼠PD-L1过表达载体并注射到HBV小鼠模型体内，发现肝细胞上PD-L1的升高会导致CD8+T细胞的耗竭；而当过表达miR-200c时，可逆转CD8+T细胞的功能衰竭（图5A-G），miR-200c在体内还可促进HBV特异性CD8+T细胞的功能（图5H-K）。同时，miR-200c过表达显著降低了HBV小鼠血清中HBV DNA和HBsAg的水平，以及肝脏组织种HBsAg和HBcAg的水平，意味着miR-200c对 PD-L1的抑制可恢复抗病毒的CD8+T的细胞功能，促进抗病毒免疫抑制HBV。在小鼠模型实验中，在注射miR-200c质粒一周后再注射HBV质粒，研究者发现预先注射了miR-200c质粒的小鼠血清中的HBV DNA和HBsAg水平显著较低，表明miR-200c过表达可能通过改善T细胞功能而抑制HBV。

 
5. HBV通过STAT3诱导SALL4下调miR-200C的表达
研究者发现，miR-200c模拟物和抑制剂都不会直接降低体外肝细胞中HBsAg和HBcAg的表达，而HBV感染显著抑制了miR-200c。已有报道指出STAT3可促使多种细胞中PD-L1表达上调，因此推测STAT3在该过程中可能发挥作用。通过比较HBV感染和未感染的肝癌细胞系中，发现HBV可增加STAT3的磷酸化水平，促进STAT3激活(图6A)。

序列分析显示，-1.5kb的SALL4启动子区有4个潜在的STAT3结合位点 (图6B)。当STAT3抑制剂WP1006处理HBV感染的细胞后，SALL4表达显著降低(图6C)。双荧光素酶报告基因实验证实了STAT3在SALL4表达调控中的作用：IL-6刺激可显著增强SALL4启动子活性，WP1006处理可显著降低SALL4启动子活性 (图6D)。 ChIP实验也表明内源STAT3可以直接与SALL4的启动子区结合(图6E)。接下来，研究者探讨了SALL4是否参与miR-200C的转录调控。结果显示，沉默SALL4显著增强了miR-200C的表达，并导致HBV诱导的PD-L1表达降低；而过表达SALL4显著降低了miR-200C的转录，增强了PD-L1的表达(图7B-E)。双荧光素酶报告基因和ChIP实验进一步证实，SALL4抑制了miR-200C的启动子活性(图7I)，并能直接与miR-200C的启动子区域结合(图7J)。

这些结果表明，HBV通过激活STAT3，进而促进转录抑制因子SALL4的表达，SALL4再与miR-200C启动子区域结合来下调miR-200C。

 

6. 沉默SALL4会阻碍HBV复制和CTL耗尽
为了进一步证实SALL4在体内促进HBV保持和HCC发展的作用，通过沉默肝脏中SALL4的表达，以观察其对HBV小鼠模型的HBV感染或保持的影响(图8A，B)。发现HBV+小鼠的SALL4和PD-L1表达较高，而miR-200C水平较低；沉默SALL4显著增强了miR-200c的转录，降低了PD-L1的表达(图8C，D)。此外，沉默SALL4显著增加了干扰素-γ+CD8+T细胞的百分比，降低了CD8+T细胞上PD-1的表达，并抑制CD8+T细胞的凋亡(图8E)，同时降低了HBV+小鼠的HBsAg和HBeAg水平(图8F)。免疫荧光染色法检测结果显示，SALL4在肿瘤中心区域的表达明显高于癌旁，而肿瘤浸润的CD8+T细胞在肿瘤中心区域的含量明显低于癌旁(图9A)，统计分析表明，SALL4表达与肿瘤浸润的PD-1+CD8+T细胞呈正相关(图9B)，表明肝细胞SALL4可能通过表达PD-L1参与HBV阳性HCC发展过程中PD-1+CD8+T细胞的耗竭。
 

结论：
本研究首次发现了HBV重新激活STAT3，通过STAT3-SALL4-miR-200c-PDL1通路促进HCC发展，并阐明了慢性病毒感染在CD8+T细胞衰竭和肿瘤进展中的作用，这是一种从内在(如HBV诱导的肝细胞PD-L1表达)到外在(如肝细胞PD-L1诱导的T细胞衰竭)途径的免疫耐受机制。miR-200c过度表达或SALL4沉默在恢复CD8+T细胞功能障碍和减少HBV复制方面有治疗潜力。此外，miR-200c与HCC患者的存活率呈显著正相关，而SALL4与存活率呈显著负相关，提示miR-200c和SALL4可能成为HCC病患者生存期预测的潜在指标。