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双荧光素酶报告基因实验原理


荧光素底物在荧光素酶作用下会发光,且光强度能反应荧光素酶的蛋白表达量。而荧光素酶的蛋白表达量,又和启动子活性、mRNA的稳定性及翻译效率等有关。利用这个特点,将待测启动子、UTR等序列与荧光素酶ORF框融合表达,再检测其发光强度,就能判断这些序列对蛋白表达的影响。这就叫荧光素酶报告基因检测。
为了减少实验误差,一般会同时转染一个能稳定表达荧光素酶的质粒作为内参,所以叫双荧光素酶报告基因检测。


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双荧光素酶报告基因实验流程


双荧光素酶报告基因实验技术服务_启动子活性检测实验.jpg

图一:启动子活性分析示意图


启动子与转录因子结合验证外包服务_转录因子验证_双荧光素酶检测.jpg

图二:启动子和转录因子互作分析示意图





应用领域



coip技术服务.bmp





双荧光素酶技术实验应用背景


双荧光素酶报告基因分析通常以萤火虫荧光素酶为报告基因,以海肾荧光素酶为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势,广泛应用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。


辉骏生物根据以下两种应用制定不同的实验方案,可针对客户情况提出合适的建议>>

1. 检测启动子活性;

2. 检测转录因子与目标启动子的相互作用。




双荧光素酶检测启动子活性研究案例—客户文章解析


封面.png


P300/YY1/miR-500A-5p/HDAC2信号轴调节结直肠癌癌细胞增殖



研究背景


结直肠癌(CRC)是全球癌症相关性死亡的主要原因之一,复发率和转移率较高。阐明CRC发生和转移的机制将有助于寻找新的诊断生物标志物和开发有效的治疗干预措施。在过去的研究中已经发现了一些参与结直肠癌形成和发展的蛋白质编码基因,然而,包括microRNA(MiRNA)在内的非编码RNA的功能在很大程度上仍需进一步研究。



研究路线

1

细胞和临床样本分析显示miR-500a-5p在CRC中低表达且与其恶行发展有关

2

荧光素酶等实验证明介导CRC细胞增殖的HDAC2是mR-500a-5p靶标

3

荧光素酶和ChIP-qPCR等实验证明YY1可以结合miR-500a-5p启动子并负调控其表达

4

Co-IP、ChIP等实验表明miR-500a-5p水平还受到YY1/P300HDAC2复合体的调控

5

小鼠模型实验确定miR-500a-5p表达可显著抑制胂瘤发展



研究结论


本研究确定miR-500a-5p在结直肠癌组织中下调,miR-500a-5p水平受到YY1/p300/HDAC2转录复合体的协同调控。此外,miR-500a-5p还通过直接结合HDAC2的3’UTR来抑制结直肠癌细胞增殖和迁移。



客户文献


Tang W.W. et al: The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer. Nature Communications. 2019, IF=12.121.





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辉骏实力

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辉骏生物提供的双荧光素酶报告检测启动子活性服务主要分为以下两种:


1. 启动子活性分析,用于检测待测启动子是否有活性及其活性区域;

2. 启动子与转录因子结合验证,用于研究某转录因子是否调控某基因的待测启动子,以及它们的结合区域。


Luc(双荧光素酶报告基因实验)检测服务
服务项目服务内容结果交付实验周期客户提供价格
启动子活性分析合成和构建2kb启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告5-6周

1、待测细胞及其培养方法

2、实验信息表

(相关基因信息)


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构建截短启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告
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启动子与转录因子结合验证合成和构建野生型启动子荧光素酶载体
载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告5-6周

1、待测细胞及其培养方法

2、转录因子基因质粒模板及其原始测序文件

3、实验信息表

(相关基因信息)


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构建突变型启动子荧光素酶载体载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告
构建转录因子表达载体
载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告
细胞培养和双荧光素酶检测检测数据和实验报告


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双荧光素酶报告基因实验*辉骏生物优势

1

近十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可

2

对启动子、转录因子、miRNA影响荧光素酶表达的具体机制理解深刻,对DNA-蛋白互作方面有独到见解,擅长针对客户情况提出合适的方案建议

3

自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线

4

售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿




Luc(双荧光素酶报告基因)技术服务样本要求


1. 送样要求


样本类型建议送样量
基因模板质粒约2ug,或甘油菌约100ul
待测细胞

(广州市内客户)可接受活细胞,2个T25瓶,细胞汇合度>80%;

(其他地区客户)冻存细胞2管



2. 样本保存和运输要求:


(1)质粒或甘油菌可用冰袋保存运输;

(2)活细胞常温取样;

(3)冻存细胞干冰取样/运输:需要至少在送样前一天通知我方。

 




双荧光素酶检测启动子活性结果示例


图片.png


图片.png

双荧光素酶报告基因检测图





双荧光素酶检测启动子活性客户文章


1. Chen R. et al: Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts. Front Cell Dev Biol. 2021, IF=6.684.
【研究内容】:本研究采用荧光素酶报告分析、pull down、ChIP、RIP等方法,研究了新型非编码RNA(LncRNA)lnc-GD2H在促进C2C12成肌细胞增殖分化和肌肉再生中的作用。结果表明,在成肌细胞增殖和分化过程中,lnc-GD2H的表达增强,且在成肌细胞增殖过程中,lnc-GD2H促进了增殖标记基因的表达,并与c-Myc形成反馈环。在成肌细胞分化过程中,lnc-GD2H与NACA相互作用,减轻NACA对Myog的抑制作用,从而促进Myog的表达,促进分化。这些结果有助于理解lncRNAs调控成肌细胞增殖和分化的机制。
使用相关技术: 启动子与转录因子结合验证,转录因子验证,双荧光素酶如何检测


2. Zhu J.Y. et al: Aryl Hydrocarbon Receptor Promotes IL-10 Expression in Inflammatory Macrophages Through Src-STAT3 Signaling Pathway. Frontiers in Immunology. 2018 , IF=4.716.

【研究内容】:本研究首次大规模鉴定了家蚕丝腺中与丝素基因启动子区域相互作用的蛋白质,包括丝素重链(Fibre H)、丝素轻链(FiBL)和一个25kD的多肽蛋白(P25)。通过DNA pull down结合质谱分析,从后丝腺中分别鉴定出198、292和247个或330、305和460个与FibH、FiBL和P25启动子区域相互作用的蛋白质。此外,在M4和L5D5中分别鉴定出135个和212个蛋白是FibH、FiBL和P25的共同互作蛋白。其中鉴定出31个潜在的转录因子,如Y-box和PolyA结合蛋白,它们在核苷酸结合、ATP结合或蛋白质折叠中发挥作用。

使用相关技术: Luc技术服务,启动子活性分析检测


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Q:

萤光素酶作为报告基因与荧光蛋白相比有哪些优势?

A:

萤光素酶的灵敏度比 GFP 高 10-100 倍以上,分析比较的动态范围更广。 萤光素酶不需要荧光显微镜检查,在体内实验中其荧光穿透率高于 EGFP 和其他荧光蛋白,而由于缺乏内源性活性,其背景信号较低。


Q:

双荧光素酶报告基因实验转染效率很低?

A:

如果转染效率低,可以从三个方面提高。 首先,我们必须确保细胞状态良好。 通常,我们选择处于分裂阶段的细胞。 或者,可以为过表达的荧光蛋白颗粒选择阳性对照。 另外,DNA的质量尤为重要,最好先验证酶切。 本实验的测试结果非常敏感,有一定的差异是正常的,通常只要确定在一个数量级之内即可。


如果差异超过这个范围,可以从两个方面进行改善,一是保持样品的均匀性,二是准确添加样品。


Q:

萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶有什么区别?

A:

1. 底物和辅因子不同: 萤火虫萤光素酶需要萤光素、氧气、ATP和镁离子才能发光; 海肾萤光素酶只需要腔肠素和氧气。 


2. 灯光颜色不同: 萤火虫萤光素酶产生的光色为黄绿色,波长为550-570nm; 海肾萤光素酶产生波长为 480nm 的蓝光。 


正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同,才被广泛用于双荧光素酶报告基因实验



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