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比较蛋白质组学常用方法

一:双向电泳
   原理:双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质,凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质,且各种蛋白质的等电点,分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用。
   优点:
      (1)经典方法、应用范围广、适用于各类材料;
      (2)经济实惠,可大规模多个样本筛选和分析。



二:双向荧光差异凝胶电泳(DIGE)
   原理:DIGE — 双向荧光差异凝胶电泳,利用荧光染料(Cy2, Cy3, Cy5)能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记,标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响,等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳,蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。
   优点:
    (1)高效性,同一块凝胶上可以电泳两个样品,减轻了工作量;

         (2)与常规银染相比灵敏度更高;
    (3)检测动态范围更大;
    (4)定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差;
    (5)统计学分析,ImageMaster7.0(DIGE)软件可以得到统计学可信的结果,降低了操作者之间的偏差。



三:化学标记法—iTRAQ定量方法
   原理:iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱中,信号离子表现为不同质荷比(113-119,121)的峰,因此根据波峰的高度及面积,可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
   优点:
    (1)灵敏度高,检测限低,可检测出低丰度蛋白;
    (2)分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定,包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白。
    (3)高通量:同时对8个样本进行分析,提高了实验通量,可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析; 
    (4)结果可靠:定性与定量分析结果更加可靠;
    (5)自动化程度高:液相与质谱连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。

 


四:化学标记法—ICAT法
   原理:ICAT试剂结构,包括3个部分,SH反应集团, biotin标签,同位素臂,试剂具有两种形式:重型(含8个氘)和轻型(不含氘),来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标记,标记后等量混合,胰蛋白酶酶切,亲和纯化得到ICAT标记的多肽,质谱分析,依据MS质谱峰图强度进行定量,MS/MS鉴定肽段。
   缺点:
    (1)它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。
    (2)ICAT分子量相对较大(约500Da),与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻
    (3)ICAT分子量相对较大(约500Da),由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上,使得在碰撞诱导解吸(CID)条件下,很容易被片段化,那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化,
    (4)ICAT分子量相对较大(约500Da),这对小肽而言是一个较大的修饰物,会增加数据库搜索的复杂性
    (5)标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合,这可能会造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。
 


五:代谢标记法—15N标记法
  
原理:在培养基中添加15N,细胞经过若干代培养后,蛋白质将完全被同位素标记,等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离,质谱鉴定和定量。根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化,根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。
   优点:
    (1)高效性:15N标记法是体内标记技术,标记效率可高达95%;
    (2)重现性:降低由于样品制备不同而造成的实验内差异;
    (3)灵活性:在培养基中添加同位素标记15N ,操作方便。

 


六:代谢标记法—SILAC
   原理:SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC),其基本原理是在细胞培养时,采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养,用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg, 细胞在传代培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质,细胞经传代培养5-6代后,细胞的所有蛋白质将被同位素标记,等量混合标记的蛋白质后经过SDS-PAGE分离和质谱分析,通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量,同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。
   优点:
    (1)高效性:SILAC是体内标记技术,标记效率可高达100%;
    (2)定量精确:线性范围广,降低由于样品制备不同而造成的实验内差异;
    (3)高通量、灵敏度高:可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质,且检可测测到纳克级水平;
    (4)相容性:可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记;
    (5)灵活性:在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸,操作方便。

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