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辉骏生物质谱技术答疑

Q:质谱仪常见的主要性能指标有哪些?
A:1、质量范围(mass range):指仪器所检测的离子的质荷比范围。
2、分辨率(resolution):指仪器分开相邻两离子质量的能力。
3、灵敏度(sensitivity):仪器出峰的强度与所用样品量之间的关系,即对选定的样品在满足一定分辨率下,产生一定信噪比的分子离子峰所需的样品量。
 
Q:关于考染后大、小斑点鉴定成功率的问题
A:一般来说,大斑点比小斑点效果好,颜色深的点比颜色浅的点鉴定成功率高。但是,由于通过PMF鉴定蛋白质是一个涉及多环节的系统工程,如不同蛋白质对染料的吸附性不同、蛋白质酶切位点的多少不同、蛋白质疏水性不同、多肽回收率不同、质谱响应度不同等因素,在这些因素的作用下,会有一些不符合一般规律的情况发生。
 
Q:质谱鉴定样品对蛋白的染色方法要求是什么?
A:蛋白质的染色常用的有4类:有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Coomasie brilliant blue,CBB)为代表,在蛋白质分析中常用,但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高,却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主,蛋白质检测灵敏度高,能兼容质谱,但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵,未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。
 
Q: 对于胶上蛋白质的鉴定,应该提供多少蛋白质?
A:一般情况下,考染能看得见的点都有机会鉴定出来。分子量在 2 -5 万之间的蛋白质,鉴定成功率一般比较大。分子量小的蛋白酶切位点少,合适的肽段( 1000 ~ 3000 Da )就少,所以鉴定的成功率相对较低。而分子量太大的蛋白质,在同等质量的情况下,蛋白的摩尔数 (pmol) 较少;而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低(因为整个蛋白质较大),从而影响鉴定的成功率。
 
Q:质谱样品怎样避免角蛋白的污染?
A:常见的角蛋白有四种,主要是从皮肤屑(直接接触)和头皮屑(空气传播)中来的。质谱中检测到的角蛋白峰应该是在酶解前就进入样品中来的(主要是在染胶,脱色,切胶和加酶这四步)。实验中一定要佩戴手套;一定要仔细清洗染胶的容器(先用 70 %酒精洗,再用去离子水洗);切胶要带口罩,并在通风橱中进行。另外,从来源于实验操作人员穿着的毛衣中的羊的角蛋白也被检测到过,所以实验中要穿实验服。
 
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