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SILAC应用之蛋白质相互作用

一:SILAC原理
   SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC),其基本原理是在细胞培养时,采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养,用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg, 细胞在传代培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质,细胞经传代培养5-6代后,细胞的所有蛋白质将被同位素标记,等量混合标记的蛋白质后经过SDS-PAGE分离和质谱分析,通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量,同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。
 

SILAC


   图1:左图是肽段的质谱峰图,质谱峰图中的峰的高度代表蛋白质的表达丰度,以质谱峰的相对强度做出蛋白质差异表达的柱状图。


二:SILAC研究蛋白质相互作用原理
  SILAC法研究蛋白质间相互作用与传统的pull down和CoIP法相比,其方法的灵敏度更高、特异性更强.其原理是通过质谱鉴定和分析蛋白质相对量来判断是否是特异性结合,实验组相对于对照组某个蛋白质量的差异达到统计学的差异时,就判定这个蛋白质与目的蛋白质有相互作用。

SILAC


  图2:细胞分别经过“Light” “Medium” Heavy”标记后,分别转然空载体,Tag-vector, Tag-bait vector, 再用Tag抗体进行CoIP,质谱分析,a表示检测到的假阳性蛋白,b表示与tag相互作用的蛋白,c表示与bait相互作用的蛋白。


三:SILAC研究蛋白质相互作用方法

1:Pull down 法

SILAC pull down

原理:
   (1):体外表达(原核表达,真核表达等),纯化出目的蛋白质(tag-bait)及目的蛋白质的对照蛋白(如Tag, Tag-control protein等).
   (2):用Tag-bait与标记上“重”型细胞的蛋白质Pull down,同时用Tag-control与“轻”型细胞蛋白质Pull down。
   (3):等量混合两次Pull down的蛋白质进行LC-MS/MS分析
   (4):交差Pull down,用Tag-bait与“轻”型细胞蛋白质Pull down,Tag-control与“重”型细胞蛋白质Pull down。

参考文献:
  Methods. 2011 Aug;54(4):387-95. Epub 2011 Mar 5

 

 

2:Tag-CoIP法   

 

Tag-CoIP SILAC
原理:
  (1):用“重”稳定同位素氨基酸标记细胞后,转染代有标签的目的蛋白质(如GFP-bait,已可用其他标签,如flag,his,biotin等)质粒进入“重”型细胞。 
  (2):提取“重”型和“轻”型细胞的蛋白质(总蛋白质,核蛋白,膜蛋白质等),等量混合“重”型蛋白和“轻”型蛋白质。 
  (3):用tag标签的抗体进行CoIP,沉淀下来的蛋白质SDS-PAGE分离后,LC-MS/MS分析

参考文献:
  J.Cell Biol. Vol. 183 No.2   223-239

 

(3) 常规CoIP法

 

CoIP SILAC
原理:
  (1):“重”型稳定同位素氨基酸标记细胞后,分别提取“轻”型细胞和“重”型细胞的蛋白质。
  (2):“重“型细胞蛋白质用目的蛋白质抗体进行CoIP,”轻“型细胞蛋白质用对照抗体进行CoIP
  (3):等量混合步骤2重CoIP下来的蛋白质或者等量混合CoIP后的Beads, SDS-PAGE分离后,LC-MS/MS分析

参考文献:
  J.Cell Biol. Vol. 183 No.2   223-239



(4)RNAi-CoIP法

 

RNAi CoIP SILAC
原理:
 (1)将细胞用“重”型同位素氨基酸标记,“轻”型细胞用目的目的蛋白质的siRNA降低目的蛋白质的表达。
 (2)等量混合“重”型和“轻”型细胞的蛋白质,用目的蛋白质的抗体
进行CoIP
 (3)CoIP后的蛋白质进行LC-MS/MS分析

参考文献:
  Nature Method. Vol.3 NO.12 DECEMBER 2006. 981


 

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