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「辉骏客户文章」Cancer Research| 胆固醇通过APMAP抑制EGFR降解诱导前列腺癌细胞转移,前列腺癌治疗或迎来新进展

发布时间:2019/5/16 10:46:07 作者:辉骏生物

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背景:
转移性前列腺癌具有很高的致命性。已有报道表明,胆固醇与前列腺癌的发展有关,但对前列腺癌细胞上皮-间质转化(EMT)的作用及潜在机制尚不清楚。了解胆固醇在前列腺癌转移中的作用及具体机制,才能为前列腺癌的治疗提供新的策略。

内容概述:
2019年4月,中国科学院苏州生物医学工程技术研究所生物医学诊断学重点实验室在期刊Cancer Research(IF2019=9.727)上发表题为“Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP”的最新论文。在这项研究中,研究者首次发现脂肪细胞质膜相关蛋白APMAP在前列腺癌侵袭转移中具有重要作用。APMAP通过减少EGFR的内吞作用参与胆固醇诱导的前列腺癌细胞EMT。该发现可能为前列腺癌的诊断和治疗提供新希望。
 
主要技术:
RNA-seq、蛋白质组学Co-IPLC-MS/MS、细胞功能实验等
辉骏生物为本研究提供了Co-IPLC-MS/MS检测和分析服务

研究路线:
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研究结果:
1. 胆固醇诱导前列腺癌细胞EMT的发生依赖于ERK1/2的激活
研究者首先探索了胆固醇对前列腺癌细胞EMT、细胞迁移和侵袭的作用。采用胆固醇处理前列腺癌细胞后,作者发现EMT标志物N-cadherin和vimentin的表达升高了,E-cadherin表达降低了,说明胆固醇会影响前列腺癌细胞的EMT;伤口愈合实验和transwell实验结果也表明胆固醇处理增加了细胞的迁移和侵袭(图1C-D)。降血脂药物辛伐他汀的处理逆转了上述作用。
另外,通过对ERK1/2, AKT, TGFb和Wnt等几种调控EMT的信号通路的检测发现:胆固醇处理可以使ERK1/2的磷酸化增加。后续的ERK1/2抑制剂实验也显示,胆固醇诱导的细胞迁移和侵袭在两种ERK抑制剂治疗后发生逆转,这表明ERK信号通路在胆固醇诱导前列腺癌细胞EMT的过程中至关重要(图1E-H)。
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2. 胆固醇促进EGFR和APMAP在脂筏中积累
为了全面了解胆固醇对前列腺癌细胞基因表达的影响,研究者对胆固醇处理的PC-3细胞进行了RNA-seq实验,并对差异基因做了生物信息学分析,其中KEGG pathway分析结果显示,差异基因主要富集在EGFR、WNT和VEGF信号通路中,而这些通路都参与了EMT(图2A)。此外,GO富集分析表明胆固醇可能参与了膜筏相关的过程,如膜筏极化、定位和分布等(图2B,C)。对前列腺癌细胞的免疫组化实验也表明胆固醇处理显著增加了细胞表面脂筏的形成(图2D)。
为了探索哪些蛋白质参与了EMT过程,作者又采用标记蛋白质组学实验分析了胆固醇处理前后的PC-3细胞脂筏中的蛋白表达变化,发现ERK1/2的上游调节因子EGFR以及和结直肠癌转移有关的APMAP蛋白在胆固醇处理后的脂筏中均有增加,western-blot实验也证实了这一结果(图2E)。为进一步确定APMAP是否参与EGFR的积累,将EGFR-RFP载体转染至APMAP缺失的PC-3细胞和对照细胞,再用胆固醇处理。在对照细胞中,胆固醇处理增强了EGFR-RFP的荧光,而当APMAP被敲除后,胆固醇对EGFR的影响几乎完全被抑制(图2F)。同时,APMAP的敲除削弱了EGFR的积累,从而降低了胆固醇诱导的ERK1/2磷酸化(图2G)。这些数据表明,APMAP增加了前列腺癌细胞中由胆固醇诱导的EGFR的蛋白水平。
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3. APMAP通过EGFR促进前列腺癌细胞EMT
接下来,研究者对APMAP基因敲除后的PC-3细胞进行了RNA-seq实验,对差异表达基因的功能分析显示:它们富集在MAPK、Notch、粘附相关信号通路以及类固醇生物合成和胆固醇代谢过程中(图3A),表明APMAP和胆固醇可能有重叠的功能。APMAP敲除显著抑制了胆固醇诱导的细胞迁移、侵袭能力和EMT过程(图3B-D)。相反,APMAP的过表达促进了迁移和侵袭,而EGFR抑制剂则抑制了这一效应(图3E,F)。此外,EGFR抑制剂显著抑制了ERK1/2的激活,并抑制了APMAP过表达细胞中EMT标志物的表达(图3G)。体内实验的结果与之类似,与对照组相比,注射胆固醇组的细胞明显形成更多的肝转移结节。胆固醇组的转移瘤组织中,EGFR mRNA、APMAP和Vimentin的表达水平均显著高于对照组,APMAP基因敲除显著降低了它们的表达水平(图3J,K)。这些数据表明APMAP通过调节EGFR参与胆固醇诱导的EMT过程。
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4. 胆固醇通过APMAP降低EGFR的内吞
为了更好的确定胆固醇如何促进脂筏中EGFR的积累,作者采用qRT-PCR技术分析了胆固醇对EGFR转录水平的影响,发现并无影响(图4A),这说明APMAP对EGFR水平的调节发生在翻译后。之后又用溶酶体抑制剂“氯喹”和/或胆固醇处理细胞,发现当不加氯喹时,胆固醇可以增加EGFR的水平,加入氯喹时,胆固醇的加入与否并不影响EGFR蛋白水平 (图4B),说明胆固醇对EGFR的作用与氯喹相同,即抑制EGFR的降解。他们接着在胆固醇处理48h后,又采用蛋白质翻译抑制剂“环己酰亚胺”在不同时间处理细胞,发现在APMAP敲除细胞中,胆固醇处理使EGFR的水平显著降低了(图4C)。
众所周知EGFR的降解依赖于其内吞,研究者推测胆固醇对EGFR降解的抑制是通过EGFR的内吞实现的。间接免疫荧光结果显示,胆固醇处理降低了EGFR和早期内体标志物Rab5在两个细胞中的共定位(图4D,E);APMAP-GFP与Rab5-RFP的共定位增加(图4F)。接下来,作者探讨了APMAP是否抑制EGFR的内吞。转染EGFR-GFP/Rab5-RFP和APMAP-GFP/Rab5-RFP至PC-3细胞,胆固醇处理后,APMAP沉默的细胞中EGFR与Rab5的共定位增加(图4G)。这些数据表明,APMAP调节胆固醇介导的EGFR稳定性。
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5. APMAP通过与EPS15R相互作用抑制EGFR内吞
研究者又使用Co-IP和LC/MS-MS技术筛选了APMAP的结合蛋白,并对它们做了GO和pathway富集分析,数据表明APMAP参与了囊泡运输。由于EPS15R参与EGFR的内吞,研究者首先通过Co-IP证实了内源性APMAP与EPS15R的相互作用(图5C),并且发现EPS15R的蛋白水平不受胆固醇的影响(图5D),质膜免疫荧光显示,因胆固醇的加入,EPS15R与APMAP的相互作用增强(图5F),并与EGFR解离(图5G)。根据这些结果,研究者推测EPS15R在APMAP介导的EGFR降解中起关键作用。为验证假设,他们在胆固醇处理的DU145细胞中进行了APMAP沉默和/或EPS15R沉默,免疫荧光显示,APMAP沉默促进EGFR向早期内体募集的作用被EPS15R的沉默所阻断(图5H)。在有胆固醇存在的APMAP沉默细胞中,EGFR的蛋白水平因EPS15R的沉默而恢复(图5I)。这些结果表明,APMAP通过与EGFR竞争结合EPS15R,抑制EGFR内吞到早期内体,从而影响胆固醇诱导的EGFR蛋白的稳定性。
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6. APMAP在前列腺癌中显著上调
为了了解APMAP在恶性肿瘤中的作用,研究者对15种癌症中APMAP的转录水平进行了分析,发现前列腺癌组织中APMAP的表达均显著高于邻近正常组织(图6B)。ROC曲线分析显示APMAP表达在预测前列腺癌组织与正常组织的敏感性和特异性(图6C)。为探讨APMAP在前列腺癌组织和正常组织中的表达情况,对80例前列腺癌患者和8例正常对照的组织芯片标本进行免疫组化染色。结果显示与正常组织相比,前列腺癌组织中APMAP蛋白的表达增加(图6D)。APMAP在肿瘤中的表达明显增高,说明APMAP可作为前列腺癌的潜在诊断标记物。

结论:
先前的研究发现胆固醇会增加侵袭性前列腺癌的患病风险,本项目研究进一步证明胆固介导APMAP上调,进而抑制EGFR降解,激活ERK1/2通路,从而促进前列腺癌细胞EMT;提出APMAP可能是一种关键的调节剂,为高脂肪饮食、肥胖和癌症转移之间提供了联系。                           
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