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iTRAQ常见10大问题及答疑

1、iTRAQ与其他蛋白质组学技术有何不同,我们该如何选择?

双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术,适用于大部分样本,只是对强酸或强碱性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好;另外由于各个样本需要单独跑胶,很难避免操作误差对结果的影响,可能导致定量不准确;但是双向电泳的服务价格相对便宜,可以用于样本差异的初步筛选;

DIGE在双向电泳基础上做了改进,引入了荧光标记物和内标,可以使定量更加准确;但该技术也是依据蛋白的等电点和分子量分离,因此对强酸或强碱性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果也不好。

iTRAQTMTlabel-freeSILAC都是利用液质联用技术来寻找差异蛋白。其中,iTRAQ和TMT的原理和检测方法基本一致,只是使用了不同的标记物;TMT有10种标记物,可对多达10种不同样本进行分析,但是由于其标记物的质量数非常相近,因此必须使用超高分辨率的质谱(Thermo公司的QE质谱仪)才可以满足检测,这也必然会导致信号干扰更多,可能会影响定量的准确性;label-free是非标记的蛋白质组学技术,由于没有标记物,其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性,该技术鉴定到的蛋白数目会少于iTRAQ技术,并且定量的准确性较差,优势是服务费用较低;SILAC是基于稳定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法,利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞,达到体内标记的目的,其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高;但是由于缺乏合适的同位素培养基,该方法基本只能用于可传代的哺乳动物细胞系。
从定量准确性、应用性等各方面综合考虑, iTRAQ技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学技术。


2、iTRAQ实验对样本有何要求?

任何类型的样本都可以,如果是罕见物种,可以用近缘物种的数据库检索,也可提供转录组数据库来检索;一次上机,每组样本需要用200ug蛋白,但由于需要蛋白定量检测和预实验,因此每组样本所需的蛋白量大概在500ug左右;我公司负责蛋白质的提取,客户只需要提供足够的原始样本。


3、不同类型的样本做iTRAQ可否一次上机?

不能。如果样品来源于不同物种,检索时就无法选择数据库,也就无法分析数据;即使是同一物种的样本,它们的蛋白种类和丰度也可能有很大差别(比如植物的根和叶),将这些酶切肽段混合上机,其数据会相互干扰,导致蛋白定性和定量的不准确。


4、iTRAQ实验是否需要设置重复?

我们常说的重复包括生物学重复和技术重复,iTRAQ中常说到的还有上机重复;生物学重复即样本重复,采集来源于同一组别的不同样本(例如同样处理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等),通常设置3个生物学重复,但临床样本一般要求生物学重复更多(如疾病组和健康组各十几例样本);当生物学重复的样本很多时,可以将同组样本混合后再标记,便可以通过一次上机检测;技术重复,通常是同一个样本用不同标记物标记,这样可以排除因蛋白提取、酶解、标记等操作引入的误差;另外ITRAQ实验有时会设计上机重复,这其实也属于技术重复的范畴,即相同的样本上两次机,来排除操作误差和仪器误差。目前发SCI论文一般需要设置重复(无论何种重复),否则可能会被质疑数据的准确性;另外从数据质量上讲,重复能更有效的帮助我们排除不可信蛋白,无论是对WB验证还是后续研究,都是很有利的。


5、iTRAQ的重复性好不好?

我们通常所考虑的iTRAQ重复性指定量的重复性,即同样的样本在上机两次时得到的结果是否一致;iTRAQ实验重复性的好坏就决定了数据的准确性。一般来说,由于质谱选取肽段的随机性,可能导致检测到的肽段及其强度不同,在经过软件匹配分析后,得到的蛋白比值可能会不一样。一般得分和比值比较靠后的蛋白才会出现定量的严重偏差,而绝大部分蛋白的比值趋势是一致的。因此在分析时,我们会将鉴定到的蛋白先按FDR(错误发现率)或unused值进行筛选,选取置信度大于95%(unused>1.3)或99%(unused>2)的蛋白作为可信蛋白,再进行分析。
 

6、我们的仪器定性和定量的准确性如何?

辉骏生物使用的是Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS System,该仪器将高性能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数(HR/AM)Orbitrap检测技术相结合,可显著提高样品的分析通量和数据质量:


> 超高分辨率(高达140,000 FWHM)——区分分子量差异的能力强;
> 质量精度优,使用全自动AGC和质量校准程序,在全扫描和全部离子碎裂(AIF)模式下质量精度优于1 ppm;
> 扫描速度快,快速扫描频率达到12Hz,与UHPLC快速色谱技术联用时可确保精确质量分析;在任何扫描模式下,快速极性切换无需牺牲质量精度;在35,000分辨率下,一个正离子和一个负离子扫描的完整周期分析仅需1秒;
> 质量范围广,扩展至50 - 6,000 m/z,可分析完整蛋白和单电荷离子;
> 全部离子碎裂(AIF)采用多重碎裂技术,离子源碰撞诱导解离(CID)和可选的高能量碰撞解离(HCD),使得MS和MS/MS数据能够得到增强的结构信息;
> 四极杆质量数过滤器:高级四极杆技术(AQT)提高母离子选择和传输能力,使复杂基质中低丰度分析物的定量更准确;
> 多重检测能力提高单个周期的分析效率:精密的数据非依赖采集(DIA)和平行反应监测(PRM)用以实现更高置信度、更好重现性以及更高通量的定量分析结果;
> 新的S型离子光学,使灵敏度提高3倍;
> 高效软件SIEVE 2.0可用于蛋白、肽段和代谢物的差异表达分析。

7、用不同标记物来标记生物学重复的样本,如何计算差异比值和选择差异蛋白?
例如有A和B两个样本,每个样本2个重复;
A1 B1 A2 B2
114 115 116 117

A1/B1=114/115,A2/B2=115/116;

常用的有2种选择差异蛋白的方法,一是根据114/115的值选出来一组差异蛋白,再根据115/116的值选出一组差异蛋白,找两个结果的集合,这种方法是比较严格的筛选方法,得到的差异蛋白数据相对较少;二是将全部蛋白的2组比值做重复性分析,根据变异系数(±50%)选择重复性较好的点,再计算2组数据的平均值,最后根据差异倍数、P值或者正态分布规律选取差异蛋白;我们现在通常选择第二种方法。

8、按什么标准来选取差异蛋白?

差异蛋白的选取目前并没有统一标准,有多种选择方法,根据比值筛选,结合比值和标准差筛选,或根据T-Test筛选;我们目前一般根据比值进行选择,即差异倍数≤0.67和≥1.5,有时也会按照p≤0.05的标准过滤。


9、iTRAQ实验的数据采用不同数据库检索时,各组间的比值为何是不同的?

iTRAQ技术中不同标记物之间的比值与检索数据库、质谱电信号的噪音以及采集质谱时的随机性都有关。所以在使用不同数据库检索时,由于匹配肽段情况的不同,定量结果也有些许差异,但是总体变化趋势应是一致的。


10、检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质?

因为一个蛋白家族中常常含有多个同源性很高的蛋白质,这些蛋白质被酶切之后,很可能会产生很多相同的肽段,软件在进行定性分析时,就会将这些肽段均归于得分最高的那种蛋白质,其他同源蛋白不计分,并且这些同源蛋白都采用同一编号。

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