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如何选择免疫组化二抗?

做免疫组化,抗体选择至关重要。本文主要给大家阐述免疫组化二抗选择的五个关注点。
 

关注点1:一抗的种属(Species)和种类(Classes)

最基本要求,二抗必须对应一抗的种属。这个无需多言。但是,一抗除了种属外,还有抗体的亚型种类需要格外关注。二抗也必须能match相应的一抗种类。这种情况在单克隆抗体需要格外注意。举例,如果一抗是小鼠IgM,那么二抗最好是抗小鼠的IgM或者IgG。

如果单克隆一抗为小鼠IgG的亚型(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2C,IgG3),那么二抗选择抗小鼠的IgG抗体即可。如果一抗的抗体亚型不确定是IgM或者IgG,那么二抗种类选择IgG,因其涵盖范围最大,将是最保险的。

如果单克隆一抗为小鼠的IgG2a型,那么选择抗小鼠IgG2a的二抗将尤其有效果。

多克隆抗体(小鼠、兔、羊、驴)一般都是IgG抗体。因此可以选择相应的IgG二抗。


关注点2:不同种属二抗质量

有人可能会问,针对单克隆小鼠一抗,兔对鼠二抗和羊对鼠二抗相比,是否有差异。目前比较一致的观点是不同种属的二抗之间无显著差异。但是,如果加入了其他范畴的影响,比如影响后续实验结果或者其他选择条件的限制等,那么对二抗的选择则依具体情况而定。

 

关注点3:二抗结合度

当面临的目标抗原浓度非常低时,需要额外纯化的抗体来尽可能降低非特异性结合。其中,IgG的成分在有效识别方面将发挥非常大的作用。

 

关注点4:标记的二抗

一般来说,二抗都已经酶标记(peroxidase, alkaline phosphatase)或者荧光标记等处理。Peroxidase特点是稳定、便宜和快速。Alkaline phosphatase特点是敏感性更好。生物素标记(biotin-conjugated)能用来产生级联放大的效果。当然,目前还开发了很多高敏系统,比如EnVision (DakoCytomation)、ImmPRESS (Vector Labs)和MACH2 (Biocare Medical),不妨一试。
 

关键点5: 预吸附处理的二抗

通过吸附一些指定动物种属的IgG,预吸附的二抗能将非特异性结合的染色结果降至最低,因此也比较受好评。举个例子,如果是研究大鼠组织,可以采用预吸附了大鼠IgG的二抗。

但是,也可能会有一些副作用。比如这类预吸附的抗体会显著影响到抗体表位的识别过程,因此会干扰某些IgG亚型(预吸附的IgG种属来源具有一定程度的同源性)的结合。

再举个例子,如果在大鼠组织或者其他组织(包含大鼠IgG)使用了小鼠一抗,接下来应该使用预吸附大鼠IgG的小鼠抗体。相反的,如果是用小鼠一抗检测确定不含有大鼠IgG的组织,最佳的方法就是接下来采用非预吸附大鼠IgG的抗小鼠的二抗。

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