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肺泡上皮细胞分离方法

肺泡上皮细胞(AECs)是肺细胞的主要类型之一,可用于分析肺上皮细胞对外界因素的反应。因此,小鼠肺部的AECs可以作为疾病的体外模型。AECs对于研究肺的发育、损伤和修复是必不可少的。从事呼吸系统疾病如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、囊性纤维化、肺气肿和肺炎研究的人员通常依赖AECs进行研究。

 

一、AECs需要特殊处理

第一次分离小鼠肺泡上皮细胞是很棘手的,肺上皮细胞周围有大量的白细胞和内皮细胞需要分离。更复杂的是,AECs需要通过分散酶消化而从肺的细胞外基质中释放出来。分散酶能特异性地裂解存在于AECs基底膜中的IV型胶原蛋白和纤连蛋白,需要通过气管艰难地注入。

 

二、区分肺泡上皮细胞的类型

肺泡上皮细胞有两种类型:I型肺泡上皮细胞(AECI)和II型肺泡上皮细胞(AECII)。

 

AECI很薄,是一种细长的鳞状细胞,主要帮助肺泡和血液之间的气体交换。AECII是一种小立方形的细胞,分泌肺表面活性物质以降低肺泡表面张力。由于AECII更丰富(大约占ACEs的60%),它们比AECI更容易分离。因此,大多数人从肺中分离出初生AECII细胞,然后对它们进行分化,以获得AECI样表型。

 

三、从小鼠肺中分离AECII细胞

分离肺泡上皮细胞最著名和广泛遵循的protocol是由M. Corti和他的同事描述的, 为了达到高纯度,不同的小组对原始协议进行了修改。如下分享一些小技巧,将帮助优化您的细胞分离方法,以获得那些>90%的纯细胞。

 

1、优化消化步骤

在肺提取步骤,优化肺组织在分散酶的孵育条件,因为它是肺组织成功消化的关键步骤,影响产量。经过尝试,最终优化得到最适条件,37℃孵育20 min,在2ml分散酶中连续旋转。

 

2、优化上皮细胞的分离

肺组织消化后,获得单细胞悬液。为了从所需的上皮细胞中分离血细胞,使用Corti等人推荐的CD45和CD16/32抗体浓度。但Corti研究中提到的磁珠分离系统比较旧,尝试使用Promega公司的链霉亲和素包被的磁珠和相应的分离柱。这种磁珠分离装置也可用于纯化其他类型的细胞(如污染白细胞中的内皮细胞)。

 

3、优化上皮细胞的纯化

根据Corti 的protocol, 磁性柱中CD45和CD16/32阴性群体(上皮细胞)可进一步纯化,在培养皿中37℃培养4h -16h。很明显,这种长时间的孵化需要优化。

 

细胞培养分别采用4h、8h和16h,并监测它们的纯度。有趣的是,4小时后已经用流式细胞仪观察到了>90%的纯度。虽然较长的培养时间导致相同的纯度,但由于上皮细胞附着在培养皿上,导致产量下降。
 

4、细胞纯度的最后检查

4小时后,细胞可以从培养皿的上清液中收集。使用Corti等人的协议,以及概述的优化步骤,获得的AECII细胞应该是高纯度的(大约90%),使用流式细胞术通过上皮细胞粘附分子(EpCAM)染色可进行检测。然后,它们可在气道上皮培养基中37℃下5% CO2进行培养。使用这种特殊培养基的优点是它支持生长而不需要添加FBS。含有FBS的培养基可以引起细胞的自发激活,在实验室中是需要避免的。

 

这些高纯度的AECII细胞可以直接用于实验,也可以进行分化,分化为AECI,通过在5% CO2、37℃,在纤维连接蛋白包被的培养板上培养7天。

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