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鉴定蛋白该用一级质谱Or二级质谱?

蛋白质组问题之:一级质谱和二级质谱的选择。

辉骏生物在以往实验中,遇到很多做双向电泳的朋友在选择2-DE的差异点做质谱的时候经常会遇到一级质谱和二级质谱的选择的问题, 常规的一级质谱鉴定,指通过一次质谱测定某个蛋白所有酶解片段的精确质量信息并对库检索实现对蛋白的定性,一级质谱又常常被称为肽指纹图谱(peptide-mass mapping,PMF)。

常规的二级质谱鉴定,指经过一级质谱之后,在获得多肽质量信息的基础上,选取某些丰度较高的多肽离子,以碰撞解离的方式碎裂成更小的片段,并依据碎片离子的质量信息进行数据库检索,实现蛋白的定性。一级质谱具有操作简单,速度快等优点,也是比较传统和经典的鉴定方法,但是对于质量相近肽段的鉴定效果差,且无法实现混合蛋白的鉴定,而二级质谱得到的信息更为丰富、鉴定的特异性更强,可靠性更高,不仅仅可以进行单点蛋白的鉴定,还可以进行混合蛋白的鉴定,甚至根据质谱信息计算出蛋白的序列而不需要数据库检索。但是除了测序以外,不管是一级还是二级质谱鉴定所得到的结果都仅仅是预测的结果,是一种相似性比较的结果,通过实际检测的蛋白点和给出结果的相似性来评价结果的好坏。至于用于一级和二级检测的仪器,则有很多种类,最常用的是MALDI-TOF(做一级质谱),MALDI-TOF/TOF(做二级质谱),MALDI-TOF系统具有两方面的优势,一是MALDI电离的离子大都只有一个电荷,质量/电荷的比值即为质量值,算法简单,另外TOF的效率是质谱仪中最高的,两种相结合自然成为质谱鉴定的首选,另外Q-TOF,ESI-MS等也有不少应用,而且也有自己独特的优势。

至于鉴定蛋白到底是该用一级质谱还是二级质谱,则有很多方面可供参考,首先,二级质谱效果比一级质谱好,这是无需置疑的;另外,从质谱仪的发展来说,最初的时候都是用一级质谱比较多,但是随着数据库的越来越多,具有极高相似性的蛋白(或者基因)越来越多,光靠一级质谱信息已经比较难获得蛋白的特异信息,而二级质谱就可以有这方面的优势,获得的信息更丰富,鉴定结果的可靠性跟高,在这个时候,很多杂志对质谱数据的要求也逐渐提高,比如某人做了100个点的一级质谱鉴定,他还必须从里面选出部分蛋白点(比如10个)再做二级质谱以验证其一级质谱可靠性,这样才能保证其一级质谱的结果可用,就像现在做mRNA芯片的肯定都要做RT-PCR验证一样。而现在,随着二级质谱技术的成熟和价格的大幅度降低(有些单位提供的二级质谱甚至比另一些单位的一级质谱还低),很多科研工作者都直接采用二级质谱对所有蛋白进行鉴定,而不再做一级质谱。

另外,一级质谱和二级质谱的选择也与物种的测序与否有一些关系,一般而言,已测序的生物采用一级质谱鉴定获得的结果还是比较可靠的,也还是被大多数杂志接受的,但是非测序生物,最好还是直接用二级质谱测定,以保证实验结果的可靠性。另外,某些需要从蛋白鉴定结果里面挑选部分蛋白做基因克隆的要注意了,对于这样的少数蛋白,最好有二级质谱的结果,以增强实验的可靠性。

辉骏生物蛋白质质谱服务信息

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