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双向电泳实验7大常见问题答疑

辉骏生物总结了以下7点关于双向电泳实验答疑,希望对要做双向电泳实验的同学带来帮助!

Q1:凝胶的蛋白鉴定一般需要多少量的蛋白?
A:现代质谱和色谱仪的检测灵敏度都是非常高的,只要肉眼能清晰可见(包括银染的点)的蛋白点都可足够进行蛋白鉴定,但是蛋白取点的时候需要注意适当地取大一些的凝胶范围,同时取尽量清晰一些的蛋白点以增加质谱鉴定的成功率。

Q2:蛋白溶解液中常用的试剂有哪几种,各是什么作用?
A:蛋白溶解液中常用试剂包括尿素、硫脲、CHAPS、DTT、IPG buffer等,尿素和硫脲是离液剂(变性剂),高浓度尿素和硫脲能够破坏蛋白质分子间形成的氢键,防止由氢键引起的蛋白质聚集以及蛋白迁移过程中二级结构的形成。CHAPS是两性表面活性剂(去垢剂),可以溶解疏水基团,增强蛋白的在其pI值处的溶解性。IPG buffer的主要成分是载体两性电解质,具有离子特性,使某些需要在盐离子存在的条件下才能溶解的蛋白保持较好的溶解性。

Q3:进行加压主动水化时,电流为零是为什么?
A:一般加压主动水化时,所加电压都很低(50V左右),而凝胶胶条的电阻比较大,导致电流在1uA以下,低于仪器的最小显示值,所以电流显示为零(实际上是有微量电流的),等后续的电压逐渐加大后,其电流也会逐渐加大而得以显示。此外,如果刚开始的电流为零,从另一个角度也说明样品中的离子含量比较低,一般都可以顺利进行后续的等点聚焦过程。

Q4:等电聚焦电泳时,为什么会产生一条向酸性端移动的蓝色条带?
A:溴芬兰是常用的颜色显示剂,同时也是一种重要的PH指示剂,在碱性条件下显蓝色,酸性条件下显黄色。在等电聚焦过程中,溶液中的痕量溴芬兰也被聚焦,形成蓝色条带并逐渐向酸性移动,同时颜色逐渐变黄。溴酚蓝的移动大致发生在小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前,可以通过溴芬兰的颜色和移动的效果初步判断等电聚焦效果的好坏。

Q5:等电聚焦为什么电压上不去?
A:等电聚焦电压不能上升到指定数值主要是因为样品离子含量过高,导致凝胶导电性强。要解决该问题,一方面可以通过适当修改提取方法及采用滤膜过滤、丙酮沉淀等策略降低样品中的离子含量,另一方面,可以在等电聚焦前的步骤中采用搭盐桥以及缓慢升压的方式除去多余的盐离子。

Q6:双向电泳图谱为什么出现横向条纹?
A:一方面要考虑聚焦时间,聚焦不完全和聚焦过度都会产生横条纹,聚焦不完全导致的横条纹比较粗,比较模糊,而聚焦过度导致的横条纹比较细且比较清晰,需要根据胶条长度和PH范围以及上样量选择合适的聚焦时间;另一方面要考虑样品提取,样品中有杂质也会引起横条纹的产生。

Q7:双向电泳图谱出现垂直拖尾是什么原因?
A:出现垂直条纹的原因有很多,引起的现象也会有所区别,比如蛋白没有被SDS充分包裹引起的横条纹会在整个区域都出现,适当延长平衡时间以及准确配置各种溶液可以解决该问题;而Tris-HCL的PH值错误也会引起垂直条纹,该条纹呈现下雨状,并且在中上部会有明显的分界线,准确调配PH值可以很好地解决这个问题;此外,样品中含有杂质,比如DNA等也会引起条纹的产生。
 

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