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如何成功验证mirRNA靶基因?

大家在前期调研中是否经常遇到这些问题:

1、通过各种在线软件进行预测获得 miRNA 靶向基因,但对 miRNA 靶基因的实际作用不清楚。

2、预测到转录因子对基因的表达起抑制或增强的作用,而具体活性以及结合位点仍然需验证。

3、未知 lncRNA 或者 circRNA 吸附 miRNA 效果。

这时候需用到萤光素酶(Luciferase)实验了。


辉骏生物介绍下荧光素酶的2个应用:

1:pGL3-Basic——用于转录因子结合位点与启动子活性分析。

当我们把待分析的启动子区段构建到 F-Luciferase 上游,和转录因子共转染分析 F-Luciferase 活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达 R-Luciferase 的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率。

启动子的作用相当于「基因开关」,能够控制基因表达的起始。而启动子的活性受转录因子的调节,转录因子是一种具有调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。一些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的 DNA 结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤光素酶报告基因分析(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

将靶启动子的特定片段插入到报告基因质粒中萤光素酶编码序列的 5』端,再与转录因子表达质粒共转染细胞,加入特定的萤光素酶底物,通过检测荧光的强度可以测定萤光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。结合定点突变等方法则可进一步确定转录因子与靶标启动子的作用。


 

2、psiCHECK2——用于 miRNA 与其靶点相关分析

包括 miRNA 靶基因验证、lncRNA 与 circRNA 吸附 miRNA 验证等。需要把 miRNA 潜在结合靶点克隆到 R-Luciferase (hRLuc) 3』UTR 区域,然后与待测 miRNA 共同转染细胞内测定 R-Luciferase 活性高低,F-Luciferase(hLuc+)作为校正内参和不同样品之间转染的转染效率。

miRNA 通常功能性作用于靶基因 3'UTR,因此可以将目的基因 mRNA3'UTR 序列插入载体 R-Luciferase (hRLuc) 3'UTR 区域, 通过比较 miRNA 引起的 R-Luciferase 活性高低来定量检测 miRNA 对目的基因的抑制作用;结合定点突变等方法则可进一步确定 miRNA 对靶基因 3'UTR 的直接靶向序列。

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1、灵敏度高,无内源性干扰;
2、检测范围宽,大于7个数量级;
3、检测速度快,样本无须孵育等预处理;
4、操作简便,可以在同一管内完成2个荧光素酶检测。

辉骏生物具体microRNA靶基因验证服务内容及实验周期可点击:http://www.fitgene.com/fuwu/xibaoshengwuxue/microRNA.html

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