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核酸标记技术介绍

一般来说,有两种类型的核酸标记技术:放射性同位素标记和非放射性标记。

 

1.放射性同位素标记:被认为是一种传统的核酸标记方法,利用ATP-γ-32P or 35P合成放射性标记的核苷酸,它们很容易被并入核酸序列,通过传统的酶法或者生物体。

 

放射性核苷酸于1935年首次被乔治·德·赫维西(1943年诺贝尔化学奖得主)用于揭示大鼠新陈代谢的组成部分。从那时起,核苷酸的放射性同位素标记被应用于许多研究和临床应用,如噬菌体复制的研究和癌症的临床诊断。

 

在DNA和RNA的应用中,放射性标记有着悠久的历史。虽然这种技术相对于非放射性标记来说成本较低,而且应用广泛,重要的是考虑在实验室中使用放射性核苷酸的安全问题。此外,如果希望在某个应用中获得单分子水平的精度,可能会考虑非放射性标记。

 

2.非放射性标(化学)标记:目前,非放射性核苷酸标记由于其相对速度快、灵敏度高、安全性好、多功能性等优点,得到了越来越广泛的应用。最常用的标记是荧光“标签”,合成并与寡核苷酸结合,也可以加入其他分子或蛋白质到化学反应基团上如生物素、链霉亲和素或荧光团等。预标记的寡核苷酸可从商业供应商处购买。

 

DNA和RNA的非放射性标记在分子生物学实验室中得到广泛的应用,荧光和反应性标记帮助研究人员研究在单个分子水平上与核苷酸相互作用的蛋白质(如FRET)。下表总结了核酸标记的一些化学方法。

 

虽然比放射性标记稍贵,荧光和化学标记的核苷酸和寡核苷酸在实验室中很容易用于各种应用类型。此外,这类修饰过的核苷酸不需要像放射性同位素处理那样进行大量的培训。

 

模板 方法 试剂 标记 标记探针 标记位点
DNA 酶法 PCR Taq 聚合酶 dNTP DNA 随机
切口平移 DNAse I/DNA 聚合酶I dNTP DNA 随机
引物延伸 klenow片段 dNTP DNA 随机
5’端标记 T4多聚核苷酸激酶 γ-32P rATP ssDNA 5’-OH
3’端标记 TdT dNTP ssDNA 3’-OH
体外转录 SP6 RNA聚合酶 NTP cRNA 随机
  T7 RNA聚合酶 NTP cRNA 5’-OH
化学法 共轭 EDC 胺类&羧酸盐/磷酸盐 DNA 5’-OH
  光反应 非特异性交联剂 核苷酸碱基 DNA 随机
RNA 酶法 逆转录 AMV/MMLV逆转录酶 dNTP cDNA 随机
5’端标记 T4多聚核苷酸激酶 γ-32P rATP RNA 5’-OH
3’端标记 T4 RNA连接酶 [5’-32P]pCp RNA 3’-OH
化学法 氧化 过碘酸盐 胺/酰肼 RNA 3’-OH
共轭 EDC 胺类&羧酸盐/磷酸盐 RNA 5’-OH
光反应 非特异性交联剂 核苷酸碱基 RNA 随机
  • dNTP或NTP可以用放射性磷酸盐、半抗原或荧光团标记。

 

如何选择合适标记方法

 

选择标记系统时,要考虑所用核酸的大小和类型。大的DNA,质粒DNA和RNA做印迹和原位杂交可以通过随机加入共价键耦合的标签来标记。虽然共价探针具有良好的敏感性,酶法在实验室中更经济方便,可以标记样品的副本(PCR标记)。对于像oligos这样的短序列,通过专门从事标记DNA的公司订购预先标记的样本可能更方便。

 

另外,也需考虑下使用标记核酸的的应用。例如,在蛋白质相互作用的研究中,由于空间位阻和化学性质,大的荧光团标签可能会中断相互作用。可以通过使用较小的标签或标记远离相互作用位点的方法来避免这种干扰。如果正在寻找信号放大,抗体偶联物如亲和素/链霉素亲和素是一个很好的选择。

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