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慢病毒实验常见问题及解决对策

Q:慢病毒对目的细胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率?
A:首先要保证细胞在感染之前处于良好的生长状态,提前24小时在细胞板上铺好细胞。其次可以使用易感细胞如293T进行滴度测试,检测慢病毒浓缩液滴度是否出现大幅下降。在此基础上适当提高慢病毒感染的MOI值和延长感染时间。另外,还可以选择在培养基中添加polybrene或更换为FItransfer培养基。

Q:加入慢病毒后,目的细胞状态很差或出现大量死亡,原因是什么?如何解决?
A:无论是用真核表达质粒转染还是用慢病毒感染,在引入宿主细胞时均可能引发细胞的毒性反应,如果所选择的宿主细胞系对慢病毒感染很敏感,则会出现严重的生理异常或死亡。针对这种情况有以下几点解决方法:首先要在感染之前保证细胞处于良好的生长状态;二是要适当降低感染的MOI值,以降低细胞的毒性反应;三是要根据细胞反应,在感染后4~12h为细胞换液,并观察细胞的反应。

Q:如何评估慢病毒的感染效率呢?
A:我们构建的慢病毒载体常常带有荧光标记基因(如GFP等),因此可在感染后3~4天后观察到荧光,可以用显微镜观察或流式细胞仪检测阳性细胞的数量;另外,还可以利用Real-time PCR检测宿主细胞中的慢病毒载体拷贝数,以评估慢病毒的感染效率。

Q:如何确定选择的宿主细胞能否被慢病毒感染?
A:由于慢病毒是一种经过改造的特殊逆转录病毒,它的感染谱很广,分裂细胞和非分裂的细胞均可以被感染。因此在实验前应该先查找相关文献,了解慢病毒感染这种宿主细胞的大致条件;但是由于很多细胞系并没有这方面的研究基础,因此在正式实验之前需要进行慢病毒感染预实验,即用空的带荧光标记的慢病毒来感染选定的宿主细胞,根据细胞是否可观察到荧光,来判断外源基因是否已经在宿主细胞内表达了。辉骏生物可针对这部分客户的需要,会为定制“慢病毒稳定株建立”服务的客户免费进行预实验,以解除您的后顾之忧。

Q:稳定细胞株筛选的药物浓度如何确定?
A:在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前,需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。对于一些常见的细胞系,通常可以在文献等资料中找到推荐的药物浓度。用G418或潮霉素B,选用在5天左右出现细胞大批死亡,2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。不同批次的药物活性有一定差异。因此在使用新批次药物时,需要重新测定最佳浓度。
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。第二天在培养基中按G418 (0,50,1000,200,400,800μg/mL)或者嘌呤霉素(0,1,2.5,5,7.5,10μg/mL)加入。

2、用G418筛选处理5~10天。每2天观察细胞一次;每4天更换新的加抗生素的培养基(如有必要可以更换得更勤),直到得到最佳浓度。

3、用嘌呤霉素处理4~7天。每2天更换新的加抗生素的培养基。



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