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慢病毒转导过程

一、概述

我们都知道,病毒缺乏复制机制,所以需要细胞来“存活”。慢病毒载体传递系统最重要的一个方面就是慢病毒载体的生产,通常在HEK293细胞(或一些变种)。

 

例如,慢病毒传递系统的一个常见用途是插入短的发夹RNAs (shRNA),用于RNAi介导的基因敲除。shRNA首先被包装成慢病毒载体,然后转染HEK293细胞。转染的细胞孵育约3天,此间慢病毒复制和产生慢病毒颗粒,然后收获,评价滴度,再转化目标细胞。

 

二、关于转染HEK293细胞

维持细胞的良好状态是必要的。HEK293细胞生长迅速,胰蛋白酶化速度快,所以不要在胰蛋白酶中长时间孵育,否则可能会有大量细胞死亡。解冻后的细胞应至少传代两次,然后接种进行转导实验。并且要非常轻柔地处理,因为细胞很容易分离。在转染实验中,HEK293细胞接种于约5*10^6细胞/10cm培养皿中,接种后次日细胞约40-50%融合。

 

三、为转导做好准备

将慢病毒载体质粒连同病毒包装载体打包成脂质体,并将其递送到HEK293细胞中。在实验的包装部分使用无血清培养基是非常重要的。无血清培养基促进DNA与阳离子脂质体复合物的形成,提高转染效率。

 

有了转染复合物,含shRNA、包装质粒和脂质体,就可以进行包装了。倾斜带有HEK293细胞的培养皿,将转染混合物逐滴加入收集的培养基中。在添加转染混合物时要谨慎,温柔操作。一旦加入溶液,小心地旋转平板,使培养基混合,将转染混合物均匀地分配到细胞上。

 

在无血清培养基中培养5-8小时。孵育后,轻轻抽吸培养基(这将包含没有转染HEK293细胞的含有质粒的脂质体),并在培养皿的一侧加入10 ml完全培养基,这样细胞就不会分离。HEK293细胞将shRNA包裹成病毒颗粒并释放到培养基中。

 

此时,培养基中会充满病毒颗粒,因此在搬运时应穿戴适当的防护用品。48小时后收集培养基(病毒颗粒),将10 ml新鲜的完全培养基加入同一培养皿中。72小时后再次收集培养基,与48小时收集的结合。通过0.45微米的过滤器对收集到的混合培养基进行消毒,以允许病毒通过。冻融循环会降低病毒的效力,所以最好进行分装。病毒可以在4℃下保存一到两个月,长期保存在-20℃。经常使用漂白剂处理在病毒产生过程中使用的吸管头和平板。

 

四、病毒进入细胞

通常,测定病毒的效价非常重要,方便确定实验浓度。一个良好的敲除,至少50%的细胞转导病毒。用适当的分析方法检查细胞是否定点敲除,通常涉及到Western Blot。

 

1.使用相同比例的病毒和细胞获得50%的转导。在一个15ml的试管中,用5ml的完全培养基重悬约200万个细胞(10cm培养皿的四分之一)。在同一试管中,加入2.5ml病毒和15ug/ml的聚凝胺。聚凝胺通过中和病毒颗粒和细胞膜之间的电荷来提高转导效率。

 

2轻轻混匀,将细胞放入一个10厘米的新培养皿中。24小时后,换到没有病毒的新鲜完全培养基中。如果shRNA构建物含有荧光标记物,可以检测转染48小时后检测是否整合成功;如果没有,继续进行抗生素选择48小时。

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