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如何检测分析ELISPOT?

ELISPOT的板底材料发展经历了普通塑料板、硝酸纤维素膜(NC膜)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)一直到最新的荷兰U-Cytech公司的透明材质的板底。传统的PVDF膜的ELISPOT板子往往需要采购特定的ELISPOT分析仪,造成一定的资源浪费,而使用透明板底的一大好处是可以采用倒置的荧光成像光路进行成像检测,这样就轮到好用强大的BioTek成像设备来大显身手了。
 

今天这个案例里是采用银染法ELISPOT检测IL-2的单因子测定,前期流程中的细胞孵育及洗板过程都可以用此前文章中提到的MultifuloFX或CBM系统来完成,当然如果您不嫌累可以手动操作。ELISPOT的最终评定是需要通过对整个孔内的细胞斑点进行定量评估,因此需要用到自动化全孔拼接的功能:

上图展示了加入和未加入Jurkat cells 及是否加入IL-2诱导化合物的成像结果,由于银染法最终会在板底形成深色的物质,所以通过明场成像即可清晰检测到斑点的形成。BioTek的Cytation及LHFX系列成像设备均带有全自动X-Y全孔图像扫描功能,设置程序后,可进行高通量成像。
 

我们如何分析ELISPOT?

由于ELISPOT是一种灵敏度极高的细胞因子检测技术,所以配套的分析软件也必须给力。首先,大部分ELISPOT在染色过程中会出现非特异性着色的斑点,在Gen5 image软件对spot进行圈选的时候,可以通过我们的散点图统计分析法,设门直接剔除直径极小的非特异性着色斑点,高端操作有木有!


上图展示了Gen5图像分析软件对一个孔内spot数量和直径的散点图统计分布,由于有效分泌IL-2的细胞产生的斑点一定是比正常的细胞直径要大的,因此可以设定剔除阈值50微米,上图中鼠标直接拖动,这部分选中的细胞就OUT了!高端,就是这么任性!

设定好目标参数后,我们就可以分析拟合细胞接种数量和半点计数的曲线了,上图的细胞给予联合激动剂50 ng/mL PMA,1 μg/mL Ionomycin,和 30 μg/mL PHA 处理24小时,每个点统计了8个副本,很大的工作量呢,不过反正我们有高端操作,编个程序就行了。
 

解锁更高端的ELISPOT技能

细胞因子参与免疫应答的过程本身是一个动态的过程,由于大部分的ELISPOT检测受到最终显色方法限制,需要手动进行时间点动力学测定,现在BioTek的智能解决方案可以提供一套基于自动化的时间点的检测流程,只需要CBM设备,即可实现不同时间点白介素分泌的自动化检测。下图可以看出,前两个小时未检测到任何spots,而在药物刺激8~10小时候,spots的数量趋于稳定。


图的细胞给予联合激动剂50 ng/mL PMA,1 μg/mL Ionomycin,和 30 μg/mL PHA 处理,每个点统计了6个副本。


通过软件的四参数拟合,最后可以得到IL-2的联合激动曲线及使用Triptolide抑制剂的抑制曲线。

此外,更可以选择新型的荧光ELISPOT的方法进行细胞水平的多因子测定,需要选择荧光的成像模块,而图像分析也更加多样化。因此,采用ELISPOT分析IL-2的分泌能够具有更高的灵敏度,使用全自动的图像采集设备,不仅可以获得清晰的全孔图片,还能够后续通过多重图像分析获得精确的斑点定量,非常适合研究平台和筛选平台使用。


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