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细胞冻存与复苏注意事项

细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

 

在不加任何物质的条件下,直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。若向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水分在冻结前透出细胞。储存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞冻存

细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油。

 

在细胞的冻存与复苏过程中,有如下事项需要注意。 

1、不要在细胞状态不好时,进行细胞冻存。如,长的太过了,培养液已经很黄了;细胞可疑污染;细胞已经开始凋亡或崩解;连续培养超过二个月,细胞性状已有改变。应该在增殖旺盛,情况稳定,实验效果良好,复苏后两周内进行细胞冻存。
 

2、冻存时细胞浓度低于1-5 ×106个/ml,很难复苏成功,应该离心后调整细胞浓度。
 

3、一定要选择原配的管子和盖子(不同牌子/型号的颜色会有差别),冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。
 

4、尽量选择程序冷冻盒进行细胞冻存。如果没有,应选择厚壁泡沫塑料盒,或塞入大量干棉花。防止放在-80℃的冻存盒,壁太薄,细胞被迅速降温。确保“缓降”。
 

5、冻存的细胞应尽快转入液氮,不要在-80℃冰箱放置超过一个月。
 

6、防止找不到或拿错细胞,每只冻存管都应标上细胞的名称,冻存时间,并记录在册。
 

7、取细胞时应做好防护措施,带好防冻手套,护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
 

8、必须在1-2min内使冻存液完全融化,复苏温度太慢,会造成细胞的损伤。如果冻存管的壁较厚,隔热效果较好,可以适当提高水浴温度(37℃~40℃)。二甲亚砜(DMSO)最好选择进口产品。
 

9、提前预定超净台,减少复苏后插在冰盒里等待的时间。复苏后长时间(1h),还没有加入新的培养液。高浓度DMSO防止胞内形成冰晶,冻存时保护细胞,但复苏溶解后,浸泡时间太久会对细胞有毒性。
 

10、关于细胞溶解后,是否需要离心的问题,需要根据特定的细胞情况而定。主要有两种方式。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液(后贴壁后即换液)。因为离心的目的是两个,去除DMSO,去除死细胞,这个是标准流程。但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大,死亡。此外在操作过程中容易污染。另一种是须离心后,将冻存液倒干净,且一定要倒干净。
 

11、对于不离心直接加入培养基培养的方法,培养基的加入量是个需要考虑的问题。主要涉及DMSO的浓度,如果你加入培养基太少,DMSO的浓度就会比较大,影响细胞生长。而加入培养基太多,又会影响细胞的贴壁效果。
 

12、DMSO的浓度在小于5%(也有说1%)的时候对一般细胞没有什么影响。所以如果你的冻存液的浓度是10%DMSO,那么1ml的细胞加入10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
 

13、有些细胞复苏后一星期才有起色,切忌要有耐心,不要换液,耐心等待,两周后再做决定。不要复苏三四天后,细胞没有任何动静,认为失败,倒掉所有细胞。

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