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建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来筛细胞呢?

稳定转染和瞬时转染,细胞转染的步骤基本相同,只是在转染后的细胞处理会不一样。由于瞬时转染只能维持几天,故在转染12~72后就可以在蛋白或基因水平进行相应的检测了。稳转细胞系通常需要通过一些选择性标记反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。

通常构建的载体上有两个抗性基因,如,氨苄青霉素和新霉素。那么建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来筛细胞呢?

很多真核表达质粒上都有两个抗性基因,但一般其中只有一个抗性可以用来筛细胞。其中氨苄青霉素对细胞是没有筛选作用的,这是用于构建克隆时筛选细菌的。所以这种情况下只能用G418。细胞转染后用G418来加压筛选,其原因是在载体上具有新霉素的抗性基因,当载体被转染入细胞后,由于细胞拥有了抗新霉素的特性,因此在用新霉素加压时,阳性细胞就不会被G418杀死。相反,未被转染入载体的阴性细胞由于没有对新霉素的抗性,那么当使用G418加压时,当然就会被杀死。

如图,这个载体就是两个抗性,Amp和neo,但两个抗性的本质区别在哪?Amp是在bla启动子驱动下表达,bla是原核表达启动子。在大肠杆菌可以表达,因此,转化后的质粒用Amp可以筛选到,而不用G418筛选。而neo是在SV40启动子驱动下表达。SV40是真核表达启动子,转入真核细胞表达。所以只有转入载体的细胞才能用G418筛选出来。
 
当然,不是什么抗生素都可以用于细胞筛选的,得看抗生素作用机理。氯苄青霉素抑制革兰氏阳性细菌细胞壁的形成,对真核生物起不到杀伤作用,因此不能用于细胞筛选。新霉素是一种氨基糖苷类抗生素,作用机制为作用于细菌核糖体的30S亚基,抑制细菌蛋白质正常合成,使细菌细胞膜通透性增强,导致细胞内钾离子、腺嘌呤、核苷酸等重要物质外漏,引起菌体死亡,从而达到杀灭细菌的作用,对真核生物也起不到杀伤作用,因此不能用于细胞筛选!

G418是一种氨基糖苷类似物,在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。原因是neo是编码3‘磷酸转移酶的基因,它在哺乳动物细胞中表达细菌APH(氨基糖苷类磷酸转移酶)基因将产生分解新霉素和G418的作用。所以这是做稳转是为什么用G418筛选了。
G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。还可以用其他的抗生素吗?

用于阳性细胞筛选的还可能有潮霉素(标有Hyg),等等。根据载体中所含有的抗性基因进行选择。比如:
1 pBlast 质粒 具有氨苄青霉素和Blast抗性,筛细菌时用氨苄青霉素,筛细胞时用Blast;
2 pZeocin质粒 具有卡那霉素和Zeocin抗性,筛细菌时用卡那霉素,筛细胞时用Zeocin。
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