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磁珠法如何有效提取核酸?

一、液化

将固体样本转化为液体样本是最重要的样本前处理方法,固体样本是很难直接在试剂盒的作用下用于提取核酸的。固体样本跟杂质一样,会严重阻碍磁珠吸附核酸,并且耗损大量的磁珠位点,很难取得良好的提取效果。

常见的固体样本如植物组织、动物组织、泥土、浓痰等。
 

植物组织和动物组织,可剪取适量的样本,在研钵内快速研磨。研磨时如果需要保护RNA,可以采用液氮研磨的方式。如果不需要提取RNA,也可以加入裂解液或者生理盐水帮助研磨成匀浆状态。泥土的处理方式主要是通过浸泡。因为从泥土中提取核酸,并非提取泥土本身,而是提取泥土中存在的微生物的核酸。使用生理盐水或者其他适当缓冲液体浸泡泥土,如果是较为干硬致密的泥土,浸泡前可以先碾碎成小颗粒,浸泡过程中可用小棒搅动帮助泥土分散。浸泡一段时间后,将泥浆用三层滤纸过滤,过滤所得的液体,即可用于磁珠法提取。
 

如浓痰、脓液等固液混合又较为黏腻的生物样本,可以先使用氢氧化钠液体进行碱解液化,再酸中和后,作为液体样本进行磁珠法提取。以上方法处理固体样本,所得的液体,可能并不完全清澈透明,杂质还是相对较多的,如果必要,使用离心的方式,可以除去更多的杂质,但相对应该控制离心速度在10000r/min以下,否则核酸也会一起随杂质被离心下去。


二、富集

很多时候,用磁珠法提取的核酸都是微量或者痕量的样本,直接使用样本进行操作,所能得到的核酸很少,这就要求下游的检测试剂灵敏度很高,如果检测试剂灵敏度不足,在样本痕量的情况下,很可能检测不出,出现假阴性。所以对于微量样本和痕量样本,可以进行富集前处理。


有些时候,样本属于常量样本,但下游实验需求核酸量大,也需要对样本进行富集,以便每个提取都能获得更多的核酸。或者样本量巨大,无法直接使用试剂盒进行提取,也需要进行富集操作。常见的富集方法包括蒸发和离心。
 

以土壤浸润水样本为例,浸泡大量的土壤样本,获得了500ml浸润水,显然无法将500ml浸润水作为样本直接提取。可以先将样本分装在两个30ml离心管内进行,12000r/min离心十分钟,弃去上清液后,用适量生理盐水重悬沉淀后,移入小离心管内,在80℃温度下蒸发液体至液体量少于300ul,即可用于磁珠法进行核酸提取。


三、除杂

很多生物样本中都含有大量的杂质,这些杂质有的可以在试剂盒核酸提取的过程中被洗涤液除去,但有些,很难通过后续的试剂盒洗涤直接除去,这就要求我们在样本前处理的时候,就直接先做初步的除杂。以大量血液样本为例,常规定量血液样本(200ul以下),通常是不需要提前除杂的。但如果血液样本的量很大,如4-5ml/提取,就很难直接进行了,不仅样本的量超过常规试剂盒的容纳范围,杂质也非常多。通常的做法是,提前加入红细胞裂解液,离心,弃去上层液体,裂解液重悬样本。各种各样的样本前处理方法是很灵活多样的,根据下游需求不同,样本特性不同,通常是多种前处理方式组合应用,以达到最佳效果。


四、结语

    总之,在磁珠法核酸提取的过程中,样本的前处理工作对整个提取结果会有至关重要的影响。当然,选取合适的磁珠,更能使提取结果事半功倍,吉恩特生物的01系列磁珠,半沉降时间可达15min以上,磁吸时间仅为15s左右,可为操作者带来不一样的磁珠操作体验。
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