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解析果蝇RNA提取分离方法

从果蝇幼虫或成虫头中分离RNA似乎有点困难,主要是由于角质层的存在。角质层是一种保护性外骨骼,由不溶性胶原蛋白、糖蛋白和脂质等组成。虽然去除角质层可能需要一些力,但可以很容易地做到这一点,而且不会影响RNA的产量或纯度。


提取RNA最主要的敌人是RNase(核糖核酸酶),它可能会悄悄消化掉所有的RNA。RNase是无处不在的,可能在你的手上、头发上、衣服上,等等。在开始任何RNA分离方案之前,用RNase-Zap擦拭工作台和工具,确保去除RNase。使用无RNase的移液器吸头,或者在使用前在盒子里进行高压灭菌。所有玻璃器皿进行高压灭菌,且只使用无菌水。

果蝇RNA提取分离方法

 

一、辉骏生物—RNA分离所需材料清单
 

1.约20-50个成年头或10-20个幼虫
2.干冰或普通冰,可以交替使用,以保持组织状态
3.RNase-Zap
4.匀浆器
5.TRIzol
6.氯仿
7.异丙醇
8.75% 乙醇
9.温度控制离心机

挑选幼虫或成蝇时,必须确保它们的角质层是干净的。并在开始实验之前,用乙醇浸泡成虫或幼虫。
 

二、辉骏生物—果蝇成虫或幼虫分离RNA的基本步骤

1、将成虫或幼虫放在5 mL的微量离心管中,用乙醇预先清洗。如果使用幼虫,要称量组织的重量。(如果组织不立刻使用,可以把管子放于液氮迅速冷冻,并于-80冰箱储存。)
将管子放于冰上。

2、如果使用幼虫,请跳到第4步! 如果使用成虫头部,管子漩涡两次,持续5秒,把头部和身体分开。头部可以通过以下几种方式与身体分离: 将头部分离后,进行称重。

3、在干冰上放置一个塑料网,然后用小刷子或钳子转移到5 mL的微量离心管中
使用黄铜筛。前筛(no. 25)会让头去到底筛(no. 40),将头部和身体分开。然后,头被转移到一个5 mL的微量离心管中,使用一个小漏斗,一个小刷子或钳子。
辉骏生物—生物实验仪器
4、将组织放入Trizol试剂中,使用TRIzol的体积取决于组织的质量。每50-100mg的组织,加入1mL Trizol试剂至离心管中。

5、组织进行匀浆。对于较大的组织,如幼虫,需要2分钟才能使组织完全均匀化。对于头部,通常需要一分钟。在进行下一步之前,确保组织被分解。

6、将匀浆在室温下孵育5分钟。

7、加氯仿到组织中,用力摇动管子15秒,室温孵育3分钟。

8、4°C离心,12000g 15分钟。这时,会看到分层现象,RNA存在于上层水相。

9、将水相(颗粒上方的液体)转移到一个新的5 mL离心管中,加入异丙醇,室温下放置10分钟。

10、4°C离心,12000g 15分钟。此时,RNA存在于沉淀颗粒中。

11、丢弃上清液,用1ml 75%乙醇冲洗颗粒,再用离心机离心5分钟。

12、丢弃上清液,真空或风干RNA颗粒15分钟。注意不能干透。

13、重悬颗粒于20 uL的水中或其他缓冲液中,如1 mM EDTA或0.5% SDS溶液(如果RNA要用于酶促反应,不要使用0.5% SDS !)孵育10分钟,通过水浴或加热于55°C可以促进重悬。注意对RNA的操作要温柔。

 

三、辉骏生物—RNA定量

分离RNA的最后一步是定量它的产量和纯度。有两种方法,一种是使用纳米滴管,但可能不是所有实验室都有。另一种是比较常用的分光光度计,在260nm测定样品的吸光度,可反映样品的总核酸含量,280 nm可测定样品的纯度。如果A260:A280的比率约为1.8(或更高),那么样本是纯的,可以使用提取的RNA进行实验应用。
辉骏生物果蝇RNA提取分离,更多课题实验咨询:4006991663

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