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串联亲和纯化(TAP-MS)

实验目的


寻找靶蛋白的互作蛋白

 

服务简介


TAP/MS是Co-IP/MS的“近亲”,两者在寻找诱饵蛋白的互作蛋白以及纯化互作蛋白的原理类似。不同的是TAP/MS引入了2个纯化标签(strep或SBP,flag),2步纯化,能有效纯化裂解液中的靶蛋白及其复合物,并使非特异性蛋白的数量降至较低水平。实验组和对照组洗脱的蛋白分别做质谱,从实验组结果中扣除对照组中的蛋白,即可鉴定出与靶蛋白互作的蛋白。


技术优势


1、TAP/MS鉴定到的互作蛋白是细胞内与诱饵蛋白天然互作的,符合体内真实生理情况,可信度高。

2、采用两步纯化,能有效减少非特异蛋白的结合。


服务内容


1、构建Flag-strep(或Flag-SBP)双标签的靶基因表达载体;
 
2、包装慢病毒感染目的细胞,做成过表达细胞株,WB检测表达效果(基因大于2kb时,可能导致病毒滴度不足以感染细胞系,此时如需进行加药筛选构建稳转细胞系,则周期预计延长3-4周);
 
3、细胞总蛋白,经streptactin 树脂(或strep磁珠)和anti-flag抗体两步纯化,并洗脱;
 
4、实验组和对照组的洗脱液分别用胰酶酶解;
 
5、LC-MS/MS分析,获得蛋白质的定量、定性信息;
 
6、实验组结果扣除对照组中的蛋白,即可得到与靶蛋白互作的蛋白。

串联亲和纯化(TAP-MS)
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