科研服务

Research Service

免疫共沉淀SILAC-IP

SILAC-IP是将SILAC标记定量蛋白质组学技术和免疫共沉淀(Co-IP)技术结合起来进行蛋白质互作研究的新方法,也是SILAC在定量蛋白质组学研究基础上的进一步应用。

SILAC-IP技术原理

通过SILAC同位素培养基标记培养细胞,不同标记的细胞分别作为Co-IP实验的实验组和对照组样本,等量蛋白采取相应的抗体进行Co-IP实验,混合IP后的各组蛋白液做LC-MS/MS检测,采用SILAC蛋白组学分析软件,获得蛋白在不同样本中的相对表达量,从而判断某一蛋白是否与诱饵蛋白特异结合。当实验组与对照组中某个蛋白质含量达到统计学差异时,即可判定该蛋白质与诱饵蛋白质存在互作。


SILAC-IP技术实验流程

SILAC-IP技术流程-辉骏生物.png
◆注意:不同的实验背景和目的需对应用不同的SILAC-IP实验方案:如果Co-IP的实验组和对照组需要使用不同的抗体,则按照上述流程进行;如果Co-IP的实验组和对照组使用相同的抗体,则在Co-IP之前进行蛋白的等量混合。具体如下:

方案一:以野生型细胞株为实验材料

1.分别用轻、重链氨基酸培养细胞,取等量标记好的细胞提取蛋白质;

2.提取的轻链、重链细胞总蛋白分别用Normal IgG和抗bait蛋白的特异抗体做Co-IP

3.混合轻、重链Co-IP产物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白(图1:成对出现的峰为非特异性结合蛋白)。

图1 正常细胞株的SILAC-IP实验设计.jpg

方案二:以过表达诱饵蛋白的细胞株为实验材料

1. 分别用轻、重链氨基酸培养正常对照细胞和过表达诱饵蛋白的细胞株(带标签),取等量标记好的细胞分别提取蛋白质,并再次定量;

2. 取等量蛋白混合,用诱饵蛋白抗体做Co-IP;

3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白(图2:成对出现的峰强一致的峰为非特异性结合蛋白)。

图2 过表达细胞株的SILAC-IP实验设计.jpg

 

方案三:以干扰诱饵蛋白的细胞株为实验材料

1. 分别用轻链、重链氨基酸培养RNAi 诱饵蛋白的细胞株和正常对照细胞株,取等量标记好的细胞分别提取蛋白质,并再次定量;

2. 取等量蛋白混合,用诱饵蛋白抗体做Co-IP;

3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白(图3:成对出现且峰强一致的为非特异性结合蛋白;由于RNAi组的细胞株内诱饵蛋白含量下降,因而与其相互作用的蛋白的丰度也相对较低,表现为峰强的减弱)

 

图3 RNAi细胞株的SILAC-IP实验设计.jpg



辉骏生物技术优势

1.特异性强,假阳性极低;

2.高通量,液相与质谱连用,能最大限度的寻找到相互作用的蛋白质;

3.灵敏度高;

4.能直接检测出与诱饵蛋白互作的其它蛋白的相对含量。

 

SILAC-IP应用范围

体内条件下验证或寻找诱饵蛋白的结合蛋白。

SILAC-IP服务信息

项目名称

客户提供

结果交付

实验周期

 



SILAC-IP

已培养7代以上的SILAC标记细胞(同位素培养基由我方提供;如委托我方培养细胞,额外收费)
诱饵蛋白的IP级抗体
实验信息表

1、标记测试结果
2、诱饵蛋白WB检测图
3、质谱检测结果
4、生物信息学分析结果
5、实验报告

 



12-14周


SILAC-IP—客户发表文献

1. UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. (2020 , IF=10.717).


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